谷氨酸脱氢酶(GDH)位于动植物以及微生物体中，对于三羧酸循环的能量代谢、细胞内氧化还原平衡、氨含量的稳态维持和信号转导的调控起着至关重要的作用。它和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中谷氨酸脱氢酶（GDH）活性。其原理是GDH催化NH₄⁺、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD⁺，NADH在340nm处有特征吸收峰，NADH的消耗引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率，计算GDH活性

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计（能测 340nm处的吸光值）及恒温培养箱

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

离心机、制冰机

去离子水

匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

提取液：即用型； 4℃保存。

试剂一：即用型；使用前平衡到室温；4℃保存。

试剂二：临用前每瓶试剂二中加入10mL试剂一充分溶解混匀，现配现用（配好后12h内用完）。

样本制备

组织：称取约0.1g组织，加入1mL预冷的提取液，冰浴匀浆。8,000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

细菌或细胞：先收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎细菌或细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后, 8,000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

血清（浆）等液体样本: 可直接测定。

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒，进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，可见光分光光度计去离子水调零。

2. 试剂二置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min。

3. 样本测定：在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中加入10μL样本和190μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A₁和5min20s后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA_测大于0.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

A. 用 96 孔板测定的计算公式如下：

1.按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位U。 

GDH（U/g 鲜重）＝[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V_样÷V_样总)÷T=1286×ΔA÷W

2. 按液体体积计算：

单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位U。

GDH（U/mL）＝[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷V_样÷T=1286×ΔA

3. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位U。

GDH（U/10⁴ Cells)=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V_样÷V_样总)÷T=2.572×ΔA

4. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位U。

GDH（U/mg prot）＝[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V_样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr

V_反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；10⁹：1 mol=10⁹ nmol；V_样：加入样本体积，0.01mL；V_样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。