辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,包括NAD+(氧化型)和NADH(还原型)两种形式。NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成ATP的同时,形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD+在细胞和体内发挥着重要的功能,其合成和降解及其产物参与细胞凋亡、代谢调控和基因表达的调控等,并且NAD+的减少是细胞死亡的主要因素之一。NAD+在调节细胞氧化还原状态方面的重要性以及调控信号通路及转录方面的功能,使得NAD+及其合成和消耗的酶成为多种疾病的潜在药物靶点。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测细胞、组织或其它样品中NAD+(氧化型辅酶Ⅰ)和NADH(还原型辅酶Ⅰ)各自的量。其原理是分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH,基于酶循环反应(不识别NADP+/NADPH),在这一反应过程中NAD+被还原为NADH,NADH将WST-8还原生成橙黄色formazan(甲臜),在450nm左右检测有大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中总的NAD+或NADH的总量呈正比关系。
酶标仪或可见分光光度计(能测450nm处的吸光度)
水浴锅、制冰机,低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿,可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
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答:可能的原因有:
1、胶浓度不对,不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差,可以调整浓度;
2、抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度,延长孵育时间;
3、酶失活,建议直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物;
4、目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体,建议查询相关文献确定;
5、标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低,建议设置阳性对照比对结果,增加标本上样量。
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