本产品适用于从琼脂糖凝胶或PCR产物、酶切产物中回收DNA,可回收100-10kb的DNA片段。采用了高效的胶溶解技术和高载量的硅基提取柱,具有回收得率和纯度高、操作简单、耗时短等优点。
本试剂盒提取的DNA可用于下游的酶切、PCR扩增、DNA测序、连接转化、文库构建等。
一、胶回收
准备工作:次使用时,在Wash Buffer中加入相应体积的乙醇。将水浴锅打开,设置为55℃。
1、在紫外灯下从琼脂糖凝胶中切下目标条带,尽量精确切割目标条带,去除不含DNA的多余琼脂糖凝胶。(尽可能缩短紫外线长照射,避免DNA因紫外照射发生交联引起突变)
2、称量切下的胶条后置于干净的2ml离心管中(可通过称量加入胶条前后离心管的重量来计算胶条重量),加入3倍胶条体积的Buffer GM。(100mg胶条相当于100μl体积。如胶条过大,可分多管溶解,每管中胶条重量不超过400mg)
注:当琼脂糖凝胶浓度>2%时,加入6倍体积的Buffer GM。
3、将离心管在55℃水浴中孵育5-10分钟,期间涡旋样品几次,直至凝胶完全溶解。
4、加入1倍胶条体积的异丙醇。
5、将提取柱置于收集管上,将样品加入到提取柱中(单次添加的样品体积不超过800μl),12000rpm离心1min,之后弃去收集管中的液体。(如样品体积过多,可分多次过柱)。
6、在提取柱中加入500μl Wash Buffer,静置2min,12000rpm离心30s,弃去收集管中的液体。
7、在提取柱中加入200μl Wash Buffer,12000rpm离心1min。
8、将提取柱置于干净的1.5ml离心管上,在提取柱中加入30-50μl无菌水或Buffer EB(尽量滴加在膜中央),静置1min后12000rpm离心1min。(使用55℃预热的水或Buffer EB能够提高洗脱效率)
二、PCR产物回收
1、将PCR/酶切产物转移至干净离心管中,加入5倍体积的Buffer PB。(如样品体积≤50μl,则加入250μl Buffer PB)
2、将提取柱置于收集管上,将样品加入到提取柱中,12000rpm离心1min,弃去收集管中的液体。
3、在提取柱中加入500μl Wash Buffer,静置2min,12000rpm离心30s,弃去收集管中的液体。
4、在提取柱中加入200μl Wash Buffer,12000rpm离心1min。
5、将提取柱置于干净的1.5ml离心管中,在提取柱中加入30-50μl无菌水或Buffer EB(尽量滴加在膜中央),静置1min后12000rpm离心1min。(使用55℃预热的水或Buffer EB能够提高洗脱效率)
1、产品可在15-25℃条件下保存15个月以上。
2、次使用时请根据试剂瓶上说明在Wash Buffer中加入乙醇。
3、Buffer GM和Buffer PB含有高浓度盐分,在低温下或长期保存会出现结晶,属正常现象。如出现混浊或结晶,可在37℃孵育5-10min,即可恢复澄清,不影响使用。
4、本产品的DNA回收率与初始DNA量有关,初始量越低,回收率越低。
5、对于<100bp或>10kb的样品,可适当增加吸附时间和洗脱时间。
6、Buffer EB可在使用前在55℃水浴预热,以增加洗脱效率。
7、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
8、本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多个修饰位点,本身可以呈现多条带,建议查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小;
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作;
3、杂蛋白多,建议处理目的蛋白;
4、抗体特异性不强,建议使用特异性强的抗体;
5、抗体孵育时间过久,建议减少抗体孵育时间;
6、二抗与抗原有交叉反应,建议选择合适的封闭物;
7、二聚体或多聚体存在,建议增加蛋白质变性过程及强度;
8、底物显色与曝光时间过长,建议缩短显色及曝光的时间。
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