异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷简称IPTG,分子式为C9H18O5S,分子量为238.30CAS号为367-93-1。IPTG是一种作用极强的诱导剂,不易被细菌代谢而且很稳定。基于这个特性,当携带带lacZ 基因载体DNA以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时,如果在平板培养基中加入X–gal和IPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互补性,可根据是否呈现蓝/白色菌落(或噬菌斑)判断出基因重组体。此外,它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。IPTG溶液(50mg/ml)经过滤除菌,一般工作浓度为1mM,主要用于诱导外源基因的表达,也用于原核表达系统,使其表达量增高,产物稳定,且易鉴定、易纯化。IPTG经常与X-Gal合用,X-Gal的工作浓度一般在5~10μg/ml。
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答:可能的原因有:
1、膜没有完全均匀湿透,建议 使用100% methanol浸透膜;
2、洗膜不充分,可以增加洗液体积和洗涤次数;
3、电极不平衡或者加样位置偏斜,可以调整电极和加样;
4、封闭物用量不足,可以提高封闭物浓度,孵育时保证封闭液完全浸没转印膜;
5、封闭物使用不当,比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭;
6、封闭时间不够,一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜;
7、抗体非特异性结合,可以降低抗体浓度,减少孵育时间;
8、一抗稀释度不适宜,可以对抗体进行滴度测试,选择适宜的抗体稀释度;
9、一抗孵育的温度偏高,建议4℃结合过夜;
10、抗体浓度过高或洗涤不够,建议降低抗体浓度,增加洗涤次数和时间;
11、化学显色底物过多,建议按说明书加入适量的显色底物。
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