本产品包含特殊修饰的Taq DNA Polymerase 、dNTP以及优化的缓冲体系,只需加入引物和模板即可进行扩增, 减少了移液操作,提高了检测通量和结果重复性。特殊修饰的Taq DNAPolymerase大大提高了扩增反应的特异性, 扩增体系中加入的保护剂使得2× Green Taq SuperMix反复冻融后仍可保持稳定活性。本产品含有绿色染料,可在反 应结束后直接进行电泳,方便快捷。
1、反应体系
2、 以 50 μL 体系为例,推荐使用的模板量如下表:
3、cDNA 模板加入体积不宜超过 PCR 反应总体积的 1/10.
4、反应程序
5、如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可将预变性时间延长至5~ 10 min以提高预变性效果;
6、循环反应中的退火温度需要根据引物的Tm值进行调整,一般设置成低于引物Tm值3~5℃即可;对于复杂模板,需要调节退火温度和延长延伸时间来实现高效扩增。
7、.延伸时间请根据目的片段长度参考以下方法进行设定: 目的片段长度<1kb,建议延伸时间为10sec/kb;1kb-5kb建议延伸时间为15sec/kb;5kb -10kb建议延伸时间为30sec/kb。
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答:可能的原因有:
1、IHC实验一抗和二抗不兼容;
2、没有足够的一抗与目的蛋白结合;
3、抗体可能不适用于IHC,因为其可能无法识别蛋白的天然(3D)形式;
4、一抗/二抗/信号放大试剂盒可能因储存不当、稀释不当或多次反复冻融而失去活性;
5、该蛋白不存在于目标组织中;
6、目的蛋白在组织中含量并不丰富;
7、二抗未避光保存(进行荧光检测时);
8、脱蜡可能不充分;
9、固定步骤可能会改变抗体识别的抗原表位;
10、抗体不能穿透蛋白所定位的细胞核(核蛋白);
11、PBS缓冲液被细菌污染,细菌会破坏目的蛋白上的磷酸基团(磷酸化蛋白);
12、抗原修复不全,对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位,以利于与抗体结合。
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