// 蛋白提取有必要测浓度吗？//

    提取的蛋白好进行浓度测定！！！方便进一步确定后续实验中蛋白的上样量。正常提取蛋白浓度时细胞样本为2-8ug/uL，组织样本蛋白浓度通常较高，一般是5-20ug/uL。不同浓度的蛋白样品的在稳定性上也有一定的差异，通常情况下蛋白浓度越高稳定性越好，对于一些低浓度的蛋白样品，可以针对性的选择更加稳妥的保存方式。此外，一些实验对蛋白浓度有着相对严格的要求，如果测得蛋白浓度不符合实验要求则可以直接放弃重新提取或采用别的方式进行浓缩处理之后再进行实验，提前测好浓度可以避免造成不必要的损失。

// 如何选择合适的蛋白定量法 //

   蛋白浓度测定常用的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法，BCA法，胶体金法、考马氏亮蓝染色法、银染法、荧光法等方法。双缩脲法由于检测灵敏度不够高，早已被 BCA 或 Bradford 法所代替。

    紫外分光光度计法是利用氨基酸在 280 nm 处有吸收峰来定量，由于不同氨基酸吸收峰值略有不同，故在蛋白质成分单一的情况下使用佳，比如蛋白纯化后估测蛋白的浓度。此法的缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

    WB实验中常用的方法是BCA法和Bradford法。

    BCA法是实验室常用的蛋白浓度测定方法，可使用普美的增强型BCA蛋白定量试剂盒（PMK0442）本方法操作更简单，试剂稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/mL），应用更加灵活。该方法的原理是蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。需要注意的是此方法受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%

    Bradford法，即考马氏亮蓝染色法，可使用普美的Bradford蛋白定量试剂盒（PMK0443）操作简单，灵敏度高，检测速度极快。可检测浓度下限达25μg/mL的蛋白样品，小检测蛋白量达到0.5μg。Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物物质的影响。样品中β-巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20、60、80低于0.015%。

// 实验小Tips //

1. BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大，吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化，如果不能精确控制显色反应的时间和温度，建议每次测定都需要做标准曲线。

2. 在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。

3. 为保证蛋白的精确定量，样品的提取和蛋白标准品的稀释配制好选用相同的缓冲液，保证两者检测条件一致。如果缓冲液本身就有较高的背景值，建议使用其他的方法测定。

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