蛋白Marker—即蛋白分子量标准，是一些已知分子量的蛋白质的混合物，像“尺子”一样用来指示蛋白条带所对应的分子量大小。此外，蛋白Marker还有表示蛋白转移成功或蛋白在凝胶上的电泳程度等作用。本期我们就来介绍一下蛋白marker的分类、选择及迁移率。蛋白Marker主要分为未预染蛋白Marker和预染蛋白Marker两种，另外还有一些其他类型的蛋白Marker：如显影蛋白Marker等。未预染蛋白Marker：是几种已知分子量并纯化好的蛋白质预混液。非预染蛋白Marker在电泳过程中看不到，电泳结束后经过蛋白染色后才能起指示作用，无法在实验过程中起预示作用。但是由于蛋白没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以准确。预染蛋白Marker：是纯化好的几种蛋白，通过与染料共价耦联后混合在一起，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到的一种蛋白Marker。预染蛋白Marker又可分为单色预染和多色预染。Marker条带越多参考价值越大，同时也越难区分，若用不同颜色则容易辨认；单色的Marker通常利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小。预染蛋白Marker在电泳过程可以起到预示作用，当观察目标蛋白大小位置进入佳分辨区时，停止电泳，以得到佳分辨效果。转膜过程可以监测转膜效率，同时可以在膜上标记蛋白分子量。但是，预染蛋白Marker与染料共价偶联，在不同的缓冲条件下，电泳迁移特性可能会发生某些变化，导致一些偏差。也就是说，预染蛋白Marker条带代表的是相对大小，而不是绝对大小。显影蛋白Marker：显影蛋白Marker，蛋白条带中含有IgG结合位点，IgG结合位点会结合用于检测靶蛋白的一抗或二抗，使得蛋白Marker在印迹膜上可与目的条带一同呈现。通常会有两个预染条带，便于动态观察蛋白质电泳状态，判断转膜效果和方向；结合抗体后经化学发光检测可显示多个条带。首先明确自己实验目的，如果只需要电泳后观察蛋白条带大小，或精确蛋白分子量，又或者需要区分大小相近的条带，可以选用非预染蛋白Marker。如果做WB实验，可以选择预染蛋白Marker，这样可以实时观察到电泳、转膜情况。选择合适的预染蛋白Marker呢？可以从以下方面进行考虑：蛋白Marker又分为高分子量、低分子量、宽分子量几类。检测大分子量蛋白经常使用到高分子量范围Marker，检测小蛋白甚至是一些多肽常会用到小分子量范围Marker。如果从整个实验室考虑，选宽分子量、条带分布比较均匀的Marker，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断。不同分子量蛋白Marker
2、条带准确性：预染蛋白Marker，染料的标记反应和蛋白质的其它标记反应一样，其实际标记效率由于各种各样的因素而波动于一个合理的区间，不是一个确定的常数。在预染蛋白Marker的生产过程中，染料标记效率的波动将直接影响到终标记产物的分子量大小。因此厂商都有一套优化的条件来实现相对稳定的染料标记效率。即使如此，标记效率的稳定性仍然不可能达到一个稳定的常数，仅能将其控制在一个比较小的波动范围。其结果是，染料标记的蛋白质产物的分子量在不同批次间会存在一定的波动。这就是我们俗称的分子量准不准的问题。由上述原理可知，没有哪家公司的预染蛋白Marker具有绝对的准确性。正如Thermo在其产品说明书中明确写道，预染蛋白Marker仅用作为蛋白质分子量的近似参考，不同批次产品间具有不大于5%的批间差异。不同的蛋白质（不考虑修饰） ，即使分子量相同，也有可能（比例较小）由于氨基酸组成的不同等因素，而表现出泳动迁移率的差异。实践中，这种看起来似乎不符合电泳原理情况常常会出现，相信做实验比较多的小伙伴可能也曾遇到过。3、稳定性：偶联染料是否容易脱落，使条带颜色变浅，Marker是否易降解。4、与膜的亲和性：转到膜上因为要经过多次洗膜，长时间孵育，所以蛋白Marker与膜的亲和性也很重要。我们有时候会观察到同一种蛋白Marker会出现分子量不同的情况，或者是实验时发现目的蛋白参照Marker时分子量好像不正确，或是出现蛋白Marker小条带消失等问题，这很有可能是因为跑胶时缓冲体系和凝胶浓度选择不当。当相同的蛋白质在不同的SDS-PAGE缓冲系统（如 Bis-Tris 和 Tris-甘氨酸）中运行时，蛋白质的迁移率会产生轻微差异。每种 SDS-PAGE 缓冲系统均具有不同的 pH 值，因而会影响蛋白质的电荷及其与 SDS 的结合能力。蛋白质迁移率的变化程度在天然蛋白质中通常很小，但对于非典型或化学修饰的蛋白质，如预染蛋白Marker，其变化更为明显。所有预染蛋白Marker的表观分子量都会因缓冲条件的不同而发生变化，所以应根据所用缓冲体系使用相匹配的表观分子量，来更准确地定位目标蛋白。同一种预染蛋白Marker在同一种缓冲体系、不同胶浓度的迁移率也是不一样的。实验时应当选择合适的胶浓度，以保证蛋白Marker条带分离清晰，且条带不会跑出凝胶。同种预染蛋白Marker在不同凝胶浓度下以及不同电泳条件下的分子量分布图A：1）由于预染的蛋白Marker与染料的偶联作用导致在不同缓冲液中Marker迁移率不同，使用前需注意选择适当缓冲体系。若使用说明书中未涉及的电泳缓冲液，建议用非预染蛋白Marker对该预染蛋白Marker先进行分子量标定；3）大分子量蛋白Western blot时需要延长转膜时间或加高转膜电压。A：有些预染Marker可以被考马斯亮蓝染色，有些不可以。原因：考马斯亮蓝含有偏酸性的基团，如R-250分子中，含有两个-HSO3，酸性基团可以结合到蛋白质的碱性基团上，从而使得蛋白染上颜色，蛋白量越高，颜色越深。预染蛋白Marker为不同大小的蛋白和染料共价结合，根据染料的不同，结合蛋白质的位置也不同，如果Marker上染料结合了考马斯亮蓝结合基团，则不能够再次结合考马斯亮蓝去染色。否则考马斯亮蓝能够结合可以染色。Q3：做WB实验时，预染蛋白Marker条带也曝光，为什么？A：预染蛋白Marker是由重组蛋白组成，可能所使用的蛋白Marker含有His标签。若一抗使用的是his标签，二抗除了跟带his标签的一抗结合外，还会跟带His标签的蛋白Marker条带结合，因此，加入ECL发光液后，蛋白Marker和样品中目的蛋白一同曝光。Q4：预染蛋白质Marker在转印过程中条带在膜上褪色？A：褪色可能是由于封闭/洗涤液中的洗涤剂将一些蛋白质从膜上洗脱造成的。染料本身不会从蛋白质上洗脱，因为它们是共价结合的。已经发现较小孔径的膜可以在封闭和洗涤过程中更好地保留蛋白质，因此，为了获得绝佳的分辨率和蛋白质保留率，推荐使用0.2 µm代替0.45 µm的膜。转印后，可以用铅笔在膜上圈出预染条带，从而在封闭和处理后仍可辨认条带位置。Q5：使用蛋白Marker转印时，小分子蛋白质条带穿过了膜，为什么？2）确保转膜缓冲液的甲醇浓度合适；可使用浓度为10–20%的甲醇，一般推荐15%，从而去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，并促进蛋白质与膜的结合。甲醇浓度太高易造成蛋白穿膜，转移到滤纸上；3）确保转膜缓冲液的SDS浓度合适(若加入了SDS)，SDS浓度不要超过0.02–0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合；4）检查膜的孔径和靶标蛋白质的大小。小于10 KD的蛋白质很容易穿过0.45μm孔径的膜。如果目标蛋白质小于10 KD，建议使用0.2μm孔径的膜。Q6：电泳后蛋白Marker条带不完全（条带缺失或无法分离）？A：1）检查使用的凝胶类型及凝胶百分比。建议在推荐的凝胶浓度范围内使用。此外，放置时间较长的蛋白胶和缓冲液也会造成电泳效果欠佳；2）检查蛋白Marker的有效日期。过期可能由于蛋白质降解导致条带褪色或缺失，通常蛋白Marker可在-20℃条件下储存一年，4℃可放置2个月；3）储存不当。不当的储存条件会损害其中蛋白质的稳定性，蛋白Marker应置于-20℃储存，低温运输；4）使用的Marker体积过大。建议按说明书推荐量添加；5）确保蛋白Marker在上样到凝胶上之前未加热或煮沸。通常蛋白Marker可直接上样，不建议将其加热或煮沸，因为这可能会导致标准品中的蛋白质降解；6）环境中存在蛋白酶污染。酶可降解大分子量Marker，由于Marker、凝胶、缓冲液、移液管或仪器在使用过程中可能受到蛋白酶的污染，建议避免在同一个房间使用蛋白酶，准备新的溶液，清洁仪器，使用干净的移液管和枪头。若Marker本身受到污染，请使用新的蛋白Marker。Q7：实验时目的蛋白参照蛋白Marker，与预期大小不符，是什么原因？A：1）预染蛋白Marker本身的准确性和迁移率的问题。可用非预染蛋白Marker进行校准；根据所用缓冲液体系使用相匹配的表观分子量，来更准确地定位目的蛋白；2）SDS-PAGE凝胶电泳按照分子量大小将蛋白分离，是蛋白在充分变性、还原条件下，使蛋白分子带上均匀密度负电荷，蛋白分子的形状是短轴一样的链状结构（单条肽链）来实现的。如果蛋白样品未充分变性、还原，其形状和电荷等因素会影响迁移率从而导致分子量与预期不符合。Q8：蛋白质电泳蛋白Marker呈“哑铃型条带”或“微笑型条带”？A：1）上样量过多。建议按照说明书使用恰当的上样体积；2）分离胶表面不平。建议采用乙醇压平分离胶表面达到水平效果；3）凝胶过期。建议提前配好的凝胶于4℃用缓冲液浸泡保存，一周内使用；4）胶未完全混匀易导致部分条带正常，部分条带“微笑型”。建议重新制备。A：1）如在凝胶两侧泳道，由于边缘效应、离子强度不均等原因，均会导致带型变宽或弯曲，建议点样时将蛋白样品点在泳道中间；
2）凝胶配制不匀，凝胶内存有气泡，配胶时凝固时间不够导致胶没有凝完全，或点样孔中有细碎的残胶；3）电泳仪问题或者缓冲液没有溶解均匀，导致电压不稳定。
