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Western Blot（WB）实验中胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能够排除下面的几个问题，那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
1、二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；
2、ECL底物中H2O2不稳定，失活；
3、ECL底物没覆盖到相应位置；
4、一抗选择不当；
5、二抗失活。
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Western Blot（WB）实验中背景高咋回事?
答：可能的原因有：
1、膜没有完全均匀湿透,建议 使用100% methanol浸透膜；
2、洗膜不充分，可以增加洗液体积和洗涤次数；
3、电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样；
4、封闭物用量不足，可以提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜；
5、封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；
6、封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜；
7、抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间；
8、一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度；
9、一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜；
10、抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间；
11、化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物。
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Western Blot（WB）实验中为啥条带形状不好看？
答：可能的原因有：
1、胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀；
2、某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致；
3、缓冲液陈旧，成分改变,可以重配；
4、凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走；
5、电泳时温度过高，可以降低电流或电压；
6、样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀。
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Western Blot（WB）实验中蛋白条带位置（大小）不对咋整？
答：可能的原因有：
1、胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度；
2、抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间；
3、酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物；
4、目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定；
5、标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量。
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Western Blot（WB）实验中有很多杂带咋回事？
答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小；
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作；
3、杂蛋白多，建议处理目的蛋白；
4、抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体；
5、抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间；
6、二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物；
7、二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度；
8、底物显色与曝光时间过长，建议缩短显色及曝光的时间。
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Western Blot（WB）实验中背景有黑色斑点或不均匀的
答：可能的原因有：
1、抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂；
2、HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓度；
3、HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体；
4、抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床。
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Western Blot（WB）实验中细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？
答：一般5×10^6就足够。
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Western Blot（WB）实验中为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
答：可能的原因有：
1、细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；
2、抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；
3、可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长；
4、细胞中的蛋白质被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性。
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Western Blot（WB）实验中我的目的带很弱，如何加强？
1、可以加大抗原上样量，这是主要的；
2、也可以将一抗稀释比例降低；
3、还可以延长曝光时间。
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Western Blot（WB）实验中我做的蛋白质分子量很小(10KD)，怎么做WB?
1、可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；
2、也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。
