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如何做血清的梯度替换？
当细胞培养实验需更换血清品牌时，做程序性梯度替换方案尤为重要，因为不同品牌的血清所含成分有所差异，血清更换会使细胞发生不适，从而出现细胞增殖缓慢或细胞状态不佳等情况。
血清梯度替换过程如下：
（1）用20%新血清与80%原血清进行混合，培养传代1-2次；
（2）用50%新血清与50%原血清混合培养传代；
（3）再用80%新血清与20%原血清混合培养传代；
（4）完全使用新血清培养传代。
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血清沉淀增多的原因及解决方法
由于在37℃的温度下培养，会加剧纤维蛋白的析出和磷酸钙颗粒产生，可采用空培方式验证污染，血清按所需比例加入无菌培养基中（不加双抗），放培养箱中过夜，观察空培外观，若为澄清，则血清无污染。还可以通过将血清接种在细菌培养基上进行培养，观察是否存在细菌增殖，并且进行革兰氏染色，用油镜观察直接判断是否为微生物污染。
血清中产生沉淀原因可能是：
① 血清热灭活；② 37℃ 孵育；③ 频繁的解冻与冻存操作；④ 解冻过程中未混合；⑤ 经γ-辐照；⑥ 2-8℃ 长时间储存；如果血清中含有沉淀，
若去除这些絮状沉淀物，可将血清分装至无菌离心管中，以3000rpm离心5-15min，去除大颗粒沉淀，收集上清液加入培养基内一起过滤。
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细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理?
一旦在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培养基是否混浊，然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。如果在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有任何变化，那么，黑点的出现可能与以下几种情况有关:
(1)细胞生长过老，破碎的细胞残骸;
(2)配制培养基的pH值偏高，不宜细胞生长;
(3)培养原代细胞中出现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除;
(4)血清等级不足以维持细胞良好的生长，更换高等级的胎牛血清。
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WB和IF的二抗是一样的吗？
不是！免疫荧光抗体是用于免疫荧光试验的，是用FITC或PE等标记的抗体，结果需要紫外线激发并用荧光显微镜观察WB抗体一般是HRP或碱性磷酸酶等标记的抗体，需显色底物（如TMB等）直接显色（肉眼）或化学发光法显影（需特殊仪器）。
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在什么情况下使用 TritonX-100？
1.Triton X-100 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(>10um 厚切片) 和免疫细胞化学中一般用 Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。
2.作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
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IHC一抗 4 度孵育后为什么要进行 37 度复温？
1.防止切片从 4 度直接放入 PBS 易脱片；
2.使抗原抗体结合更稳定。通常情况下不需要,但对表达较弱的抗原可能有用。4 度和 37 度时分子运动方式不同, 前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
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DAB 显色时间如何控制？
1.DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
2.DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；
3.若很短时间就出现背景很深，还有可能前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
4.DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，可能由于抗体浓度过低或孵育时间过短（好一抗 4 度过夜）或者是封闭时间过长。
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对照孔的作用是什么？必须要设置对照吗？
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Western Blot（WB）封闭步骤需要多久？
使用常规封闭手段如脱脂乳封闭需要室温下孵育90min，使用普美无血清封闭液可室温下15-30min。
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试剂盒的检测范围和灵敏度分别代表什么意思？
灵敏度是试剂盒多次检测空白样本计算得到的低检出限，只有样本浓度高于试剂盒的灵敏度时检测具有意义。
试剂盒检测范围是表示当样本浓度在该范围内，其浓度和检测OD值具有良好的线性更新，能够准确定量样本的浓度情况。
