裂解液通常可以通过使用有机溶剂例如甲醇、丙酮等,或者使用去垢剂例如Triton X-100、Saponin等来实现对于细胞膜的通透。甲醇或丙酮等有机溶剂,一方面可以溶解细胞膜和核膜从而充分暴露细胞浆和细胞核中的目的蛋白等,另一方面也可以使细胞内的蛋白变性起到固定的作用。Triton X-100裂解液是常用的通透试剂,可以通透细胞膜和核膜,作用的原理也是非特异性地溶解细胞膜,因此其缺点是不利于膜蛋白的检测,但当使用多聚甲醛进行交联和固定后,相当一部分膜蛋白会被交联固定,从而不会被Triton X-100裂解液溶解,因此后续仍然能检测到。本Triton X-100裂解液中含有Triton X-100等去垢剂,配制在PBS中。经过本Triton X-100裂解液处理的样品,对于细胞浆或细胞核内目的蛋白的免疫染色检测结果表明,染色效果与常规的通透液相比基本一致或略有增强。按照每个样品需要1ml Triton X-100裂解液计算,一个100ml包装的本产品可以通透1000个或100个样品,一个500ml包装的本产品可以裂解5000个或500个样品。
1. 对于切片,在固定、洗涤结束后,每样滴50-100μl Triton X-100裂解液,也可以在染色缸中完全浸没进行裂解。对于细胞样品,在固定、洗涤结束后,按照六孔板每孔加入1ml Triton X-100裂解液,其它多孔板参考该比例加入。对于其它样品,加入Triton X-100裂解液的量以充分盖住样品为准。
2. 通常在Triton X-100裂解液中室温孵育5-10min,即可完成通透。对于较难通透的样品或者要求通透特别充分的情况,可以在Triton X-100裂解液中室温孵育10-30min。
3. 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
1.Xiang J ,Tang J ,Kang F , et al.Gut-induced alpha-Synuclein and Tau propagation initiate Parkinson's and Alzheimer's disease co-pathology and behavior impairments.[J].Neuron,2024,112(21):3585-3601.e5.(IF 14.7)
答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多个修饰位点,本身可以呈现多条带,建议查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小;
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作;
3、杂蛋白多,建议处理目的蛋白;
4、抗体特异性不强,建议使用特异性强的抗体;
5、抗体孵育时间过久,建议减少抗体孵育时间;
6、二抗与抗原有交叉反应,建议选择合适的封闭物;
7、二聚体或多聚体存在,建议增加蛋白质变性过程及强度;
8、底物显色与曝光时间过长,建议缩短显色及曝光的时间。
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