本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取胞质蛋白,用裂解液匀浆裂解组织或细胞 ,作用温和,提取过程简便高效,可快速获得胞质蛋白。 获得的总蛋白可用于报告基因检测、蛋白质纯化、Western Blot、免疫共沉淀等后续研究 ,但不能用于蛋白激酶及磷酸酶的研究 ,因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。
组织胞质蛋白的提取
1.提取液的用量和配制:每0.1g组织需要0.75-1ml胞质蛋白提取液;每1ml冷的胞质蛋白提取液中加入20ul磷酸酶抑制剂混合物、10ul蛋白酶抑制剂混合物和10ul PMSF混匀,放置在冰上备用;
2. 称取新鲜组织,放置于玻璃匀浆器的入口缓冲处,用眼科剪将组织块尽可能剪碎,然后加新配置的胞质蛋白提取液,研磨直至没有明显的组织块,这个过程注意冰上操作;
3. 将组织匀浆液移入1.5ml 预冷的EP 管中,高速涡旋振荡5秒,4℃ 12000 g 离心10min;
4. 吸取上清至新的预冷的离心管中,即为胞质蛋白提取物;
5. 进行蛋白定量或者变性进行蛋白实验 。( 提取好的蛋白建议保存于-80℃,即用即取,避免反复冻融,避免长时间储存)
细胞胞质蛋白的提取
1. 提取液的用量和配制:107个细胞需要0.75-1ml胞质蛋白提取液;每1ml的冷的胞质蛋白提取液中加入20ul的磷酸酶抑制剂混合物、10ul蛋白酶抑制剂混合物和10ul PMSF混匀,放置在冰上备用;
2. 贴壁细胞:弃去培养基,加入冷的PBS清洗,弃去PBS后加入胰酶消化液消化30s-2min,4℃1200g离心10min收集细胞,再用冷的PBS清洗一次,后按细胞数加入胞质蛋白提取液,涡旋10s,放置冰上裂解10min,重复2-3次;
3. 悬浮细胞: 4℃ 500g~800g离心10min收集细胞,再用预冷的PBS洗两次细胞,500g~800g离心去上清。按细胞数加入胞质蛋白提取液,涡旋10s,放置冰上裂解10min,重复2-3次;
4. 裂解完毕之后,将细胞裂解液4℃12000g离心10min,取上清为胞质蛋白提取物;
5. 将上清移入新的EP管中,进行蛋白定量或者变性进行蛋白实验。(提取好的蛋白建议保存于-80℃,即用即取,避免反复冻融,避免长时间储存)
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答:如果能够排除下面的几个问题,那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
1、二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光;
2、ECL底物中H2O2不稳定,失活;
3、ECL底物没覆盖到相应位置;
4、一抗选择不当;
5、二抗失活。
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