水溶性的SulfoCy5 SE=Cy5 NHS=Cy5琥珀酰亚胺酯 (琥珀酰亚胺酯SE(Succinimidyl esters) = N-羟基琥珀酰亚胺NHS(N-Hydroxy succinimide)

菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是高的，其琥珀酰亚胺酯是常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。通过改变次甲基链的长度, 可改变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照Huoffman规则正好红移约100nm。菁染料Cy3和Cy5已成为基因芯片的首选荧光标记物;另外,Cy5, Cy5.5和Cy7的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度高、稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。

菁染料琥珀酰亚胺酯（CyDye NHS）的标记：

菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之间荧光强度高， F/P值过过高荧光探针会自我淬灭并影响生物分子的生物活性，标记生物分子好是用单琥珀酰亚胺酯，但是用双修饰的CyDye NHS并没有发现交联。 CyDye NHS标记抗体在pH (8.5～9.4)时10分钟F/P可达5～6，而在pH 7.0几乎不反应。我们用不同比例的 Cy3标记anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗体发现用1:1, 5:1,10:1 和 20:1标记时得到的F/P值分别是0.28:1, 1.16:1, 2.3:1 和4.6:1。

1. 水溶性Cy3 NHS标记anti-GST多克隆抗体

市场上买到的抗体如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或带氨基的缓冲液会影响标记， 在标记前需纯化。

(1) 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗体(浓度为 0.5 mL at 3 mg/mL)，常温透析4小时。

(2) 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析过夜。

(3) 第二天用1 L 0.1 M NaHCO₃ (pH 8.3)透析4小时。

(4) 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

(5) 用0.1 M NaHCO₃ 稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 （IgG antibody摩尔 吸光系数170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).

(6) 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95) 溶液浓度为10 mg/mL； 计算所需体积以得到想要的CyDye NHS 和抗体的比值(例如20:1)，然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45分钟。

(7) 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3。

(8) 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜。

(9) 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液常温避光透析4小时, 在4°C常温避光再次透析过夜。

(10) 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

(11) 用0.01 M PBS/0.01 % 叠氮化钠整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm（蛋白）和552nm（Cy）处的紫 外可见吸光度。

(12) 产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液中，-20℃避光储存。

F/P计算： Cy3在552nm摩尔吸光系数为150 000 M-1 cm-1 ；此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170 000 M-1 cm-1 ;不同蛋白的摩尔吸光系数不一样，Cy3 染料本身在280nm的吸收是552nm处的8%。按以下公式计算F/P值。

[Cy3] = A552/150000 [antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000

F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280 - (0.08×A552)}

2. 水溶性Cy5 NHS标记 (D-ser 2 )-leucineenkephalin

(1) Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2 )-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）

(2) 然后加入15 μL三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。

(3) 用HPLC 纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上样注入2×400 μL，30分钟梯度洗脱从 0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0.1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（对不同的蛋白选择不同的合适HPLC梯度流动相）

(4) 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽。

(5) 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光储存；必要时可用质谱表征。

(6) CyDye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4 ℃可避光保存2月；更长期的保存需加⼊等体积的甘油-20 ℃避光保存。

F/P计算： Cy5 在650 nm 的摩尔吸光系数为250 000 M-1 cm-1 ，所用蛋白在280 nm处的摩尔吸光系数为 170 000 M-1 cm-1 ；Cy5在280nm处的吸收是650nm处的5%。按以下公式计算F/P值。

[Cy5 dye] = (A650)/250 000 [peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170 000

F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/ {A280 - (0.05×A650)}

3. 水溶性 CyDye SE标记OLIGO

氨基封端的OLIGO可以标记CyDye SE，但是非常困难；标记前因为OILGO经氨水脱保护，请务必洗涤掉 所有的残余氨水。然后将样品真空干燥；然后溶于0.25 ml 的0.5 M NaCl 溶液中，用Sephadex G-50脱盐，用5.0 mM borate 缓冲液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸缓冲液冲下OLIGO。然后浓缩至干的样品溶于 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在0.5mL碳酸缓冲液中30 nmoles的OLIGO加入到CyDye SE的玻璃 瓶中室温避光，密闭搅拌反应60min。反应物经Sephadex G-50或 RP-HPLC过柱纯化，冷冻⼲燥后避光保存。

4. 活体成像领域

SPF级 BALB/C裸鼠，6-8 周龄, 18-20克, 实验前24 h 自由进食、饮水。

于实验裸鼠腹腔内注射 2%戊巴比妥钠 300μL(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将 Cy7 或 Cy7 标记的生物分子或药物 DMSO 稀释后,于裸鼠尾静脉注射 200μL( 0.5 mg/g) [佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化] ,每 5min 记录 1 张动物在体内发射荧光的成像图片,分析荧光药物的分布情况。对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，进行成像。

Cy7 检测时激发波长700～770 nm 带通 ,发射波790 nm 长通。液晶可调谐滤光片扫描范围 780～950 nm ,扫描步进 10 nm。曝光时间为 500 ms。

不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈现显著的肾 排泄的特点一般 4~6 小时，快得只有 30 分钟；如果是⻣骼等部位靶点的 Cy7 标记药物，有客户反映一周后 活体成像系统仍能检测到荧光成像。

器官切⽚观察：将解剖的器官迅速放置于 4%多聚甲醛固定 4 小时以上，0%，20%，30%PBS蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，晾干，DAPI 染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖 633 nm。

未开封的粉末在避光⼲燥-20℃存放12月。CyDye NHS⽔溶液现配现用不能储存。任何溶解后的CyDye NHS粉末好立即使用；无水的DMSO溶液-20°C保存多2个星期。