该试剂盒采用竞争抑制酶联免疫吸附法原理。酶标板预包被亲和纯化的抗雌二醇(E2)的抗体。将待测抗原（标准品或样本）和生物素标记的抗原加入到酶标板中，它们对固相抗体进行竞争结合。接着洗涤去除未结合的物质，加入链酶亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）以形成固相抗体-生物素标记抗原-SA-HRP的复合物。然后，将 TMB 溶液加入孔中并进行孵育，酶促反应产生蓝色物质，加入终止液后，变成黄色。颜色深浅与样本中待测抗原的含量呈现负相关。在450nm 波长下测定吸光值。后通过建立标准曲线，根据 OD 值来计算样品中雌二醇(E2)的浓度。

酶标仪（能测 450nm 处的吸光度）

多通道移液器或自动洗板机

恒温箱、低温离心机

可调节式移液枪及枪头

去离子水

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

1.使用前将所有试剂平衡至室温(18-25℃)。按照酶标仪说明书进行设置检测波长为450nm，并在读板前预热 15 分钟。

2.洗涤液:取浓缩洗涤液，根据检测数量，用去离子水或蒸馏水1：30稀释，混匀后备用。

3.检测试剂 A 工作液：实验前计算所需量(100 μL/孔)。在准备工作中，应该准备比计算量稍微多一点（多 100-200μL）。使用前将原液管离心，用检测试剂 A 稀释液将 100×浓缩检测试剂 A 稀释至 1×工作液（如：10μL 检测试剂 A + 990μL 检测试剂 A 稀释液）。

4.检测试剂 B 工作液：实验前计算所需量(100 μL/孔)。在准备工作中，应该准备比计算量稍微多一点（多 100-200μL）。使用前将原液管离心，用检测试剂 B 稀释液将 100×浓缩检测试剂 B 稀释至 1×工作液（如：10μL 检测试剂 B + 990μL 检测试剂 B 稀释液）。

5.标准工作液：首先，标准品 1000×g 离心 1min，加入1mL标准品稀释液，使其静止10min 再轻柔混匀，这就是20ng/mL工作储备液,然后取7个EP管，每管内加入500μL标准品稀释液。吸取 500μL 20ng/mL标准品稀释液到个管内再混匀即为10ng/mL 工作液。按照下表将500μL的溶液从前管移到后管中。在下一次转移前，将每管彻底混匀。设定7个梯度稀释标准品如20ng/mL,10ng/mL,5ng/mL,2.5ng/mL,1.25ng/mL， 0.625ng/mL,0.31ng/mL后1个装有标准品稀释液的 EP 管是空白对照作为0ng/mL。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品。

血清：让血样在室温下凝结 2 小时或在 2-8℃下过夜，然后在 2-8℃下 2000×g 离心 15 分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃备用。

血浆：使用 EDTA 或肝素作为抗凝剂收集血浆。采集后 30 分钟内，在 2-8℃,2000×g 条件下离心样品 15 分钟，随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

组织匀浆：应在预冷的 PBS 中冲洗组织，彻底清除多余的血液，称重，切成小块。然后在冰上的采用玻璃匀质器在 PBS（组织重量（g）：PBS（mL）体积=1：9）中均质化组织块。使用超声波细胞破碎机对所得匀质悬浮液进行超声处理，直到溶液澄清。然后将匀浆在 10000×g 下离心 5 分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

细胞裂解物：对于粘附细胞，用适量预冷的 PBS 轻轻清洗细胞，并用胰蛋白酶分离细胞。以 1000×g 离心 5 分钟收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集）。弃上清，用冷 PBS 清洗细胞 3 次。以浓度为5×10⁶ 个细胞/1mL 预冷 PBS 重新悬浮细胞。重复冻融数次，直到细胞完全溶解。1500×g，2-8℃离心 10min。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

细胞培养上清和其他生物体液：在 1500×g，2-8℃条件下离心样品15分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

注意：不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在6天内使用，则可以将其储存在2-8℃，长期保存需分装存储在-20℃或-80℃，避免反复冻融。测定前，应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。

1.分别设置标准品孔和样本孔。依次加入 8个不同浓度的标准品（含零孔，50μL/孔），样本孔加入50μL待测样本（根据实际情况确定是否设置复孔），然后立即加入检测试剂A工作液，50μL/孔，轻轻晃动混匀，盖上试剂盒提供的封板膜，37℃孵育60分钟。

2. 手工洗板：弃去每孔中的液体，每孔加入350μL洗涤液。浸泡30秒再倒出每孔中液体并在干净的吸水纸上拍干。重复这个洗涤步骤，共3遍。洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。

3.每孔加入100μL 的检测试剂B工作液。盖上封板膜。37℃孵育30分钟。

4.弃去每孔中的液体，重复步骤 2 的洗涤过程5遍。

5.每孔加入90μL 的TMB试剂。盖上新的封板膜。37℃避光孵育 10-20 分钟（当标品浓度梯度后三孔有明显蓝色梯度，前三孔的梯度不明显时即可终止）。

6.每孔加入 50μL 的终止液，顺序与加入底物溶液(TMB)的顺序一致，轻轻晃动混匀。

7.确保酶标板孔底无气泡水雾等，立即在 450nm 测量每孔的吸光度 OD 值。

以x 轴为OD值，y轴为标准品浓度拟合一条标准曲线，通过回归分析确定回归方程。将样本OD值作为x带入方程计算y值（浓度）。

典型标准曲线（R2≥0.99）

雌二醇(E2)标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。终止液有一定的腐蚀性，操作时请做好防护措施。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。收到试剂盒后，未开封的试剂盒可在2-8℃下保存1个月。如果试剂盒在1个月内不使用，请在收到试剂盒后，将每个组件分别存放在上表中指示的温度下。

4. 新打开的ELISA酶标板可能含有水雾样物质，此为正常现象，不会对实验结果产生任何影响。未用完的板条应立即放回装有干燥剂的铝箔袋中，重新密封并在-20℃下存储。

5. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

6. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。

7. 溶解含有蛋白质溶液时，应始终避免起泡。

8. 不得重复使用稀释后的工作液。

9. 为了得到准确的实验结果，在孵育过程中，必须确保封板膜将酶标板密封。

10. 在使用自动洗板机时，添加清洗缓冲液后，在清洗步骤之间添加30秒的浸泡时间可提高分析精度。

11. 底物溶液(TMB)保存过程中应为无色，加入到酶标板中之后底物溶液应从无色变为渐变蓝色。

12. 终止液应按照与加底物溶液(TMB)相同的顺序添加到酶标板中。添加终止液后，孔中溶液的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表明终止液未与底物溶液充分混合，应轻拍孔板使其混匀。