海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1 糖苷键连接而成的一种非还原双糖,广泛存在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、无脊椎动物和高等植物等多种有机体中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性。另外,它本身具有很强的吸水性,使它在生物体内具有抗脱水作用,在逆境条件下可保护植物免受不良环境的伤害。植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖,该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)的作用下,催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和 6-磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖,再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose 6-phosphate phosphatase,TPP)的作用下去磷酸化,生成海藻糖。因此,测定TPS活性对于研究植物逆境具有重要意义。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的TPS活性检测方法,其原理是:TPS催化UDPG与G6P生成海藻糖-6-磷酸,同时产生UDP;UDP在丙酮酸激酶与乳酸脱氢酶作用下,氧化NADH为NAD,NADH在340nm下有特征吸收峰,而NAD没有。NADH的下降速率与UDP含量成正比,通过测定340nm吸光度下降速率反映TPS活性。
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机,低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多个修饰位点,本身可以呈现多条带,建议查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小;
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作;
3、杂蛋白多,建议处理目的蛋白;
4、抗体特异性不强,建议使用特异性强的抗体;
5、抗体孵育时间过久,建议减少抗体孵育时间;
6、二抗与抗原有交叉反应,建议选择合适的封闭物;
7、二聚体或多聚体存在,建议增加蛋白质变性过程及强度;
8、底物显色与曝光时间过长,建议缩短显色及曝光的时间。
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