γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）是还原型谷胱甘肽（GSH）合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性的高低对于GSH含量和GSH/GSSG比值有非常重要的影响。 本试剂盒可检测生物体内GCL活性，其原理是在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。
酶标仪或可见分光光度计（能测660 nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水和浓硫酸
匀浆器（如果是组织样本）
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：临用前96 T加6 mL去离子水，48 T加3 mL去离子水，充分震荡溶解，用不完的试剂分装-20℃保存，避免反复冻融。
试剂二：临用前加96 T加1.5 mL去离子水，48 T加0.75 mL去离子水，充分震荡溶解。（配制完成后，4℃保存，请一周内使用完。）
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂四：临用前96 T加12 mL去离子水，48 T加6 mL去离子水，充分震荡溶解后，96 T缓缓加入400 µL浓硫酸（自备），48 T缓缓加入200 µL浓硫酸（自备）边加边搅拌。
注意：浓硫酸具有强腐蚀性，请注意安全。配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。该溶液配制完成后应为浅黄色，若为蓝色则已污染，不可再使用。
标准曲线设置： 按下表所示用去离子水将8μmol/mL标准液稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.125 μmol/mL标准溶液。
标准品体积 | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（μmol/mL） | |
Std.1 | 100 µLof 8 μmol/mL | 900 | 0.8 |
Std.2 | 100 µL of Std.1（0.8 μmol/mL） | 100 | 0.4 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (0.4 μmol/mL) | 100 | 0.2 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (0.2 μmol/mL) | 100 | 0.1 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (0.1 μmol/mL) | 100 | 0.05 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (0.05 μmol/mL) | 100 | 0.025 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (0.025 μmol/mL) | 100 | 0.0125 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
1. 动植物组织样本：称取约0.1 g组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌、细胞：收集500万细胞加入1 mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次）；然后8,000 g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。
3. 血清（浆）等液体：直接测定。
注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。
2. 细胞中GCL活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GCL的提取时可加提取液后超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
3. 如需要进行样本蛋白质浓度测定时，推荐用BCA法蛋白质定量试剂盒。
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到660 nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 水浴锅预热到37℃。
3. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） | 对照管（μL） | |
提取液 | 0 | 0 | 48 | 48 |
试剂一 | 0 | 0 | 52 | 52 |
试剂二 | 0 | 0 | 12 | 12 |
样本 | 0 | 0 | 24 | 0 |
混匀后盖紧，37℃水浴反应15 min | ||||
试剂三 | 0 | 0 | 60 | 60 |
样本 | 0 | 0 | 0 | 24 |
混匀后，室温（25℃左右）8,000 g，离心10 min | ||||
上清 | 0 | 0 | 100 | 100 |
标准品 | 0 | 100 | 0 | 0 |
去离子水 | 100 | 0 | 0 | 0 |
试剂四 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却至室温后测定660 nm处光吸收，尽快测完，分别记为A空、A测定、A标、A对照。计算 ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白，空白管只需做一个 | ||||
注意：测定吸光值时，请于水浴后10-40min内测完。样本测定前先取2-3个样做预实验，如ΔA测大于1.5，应先用提取液（或生理盐水）稀释到适当倍数，使得吸光值在标准曲线范围内，哺乳动物组织和血液一般稀释3-5倍，计算公式中乘以相应稀释倍数。
1. 标准曲线的绘制：
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2. γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）活性的计算
根据标准曲线，将ΔA测带入公式中（x）计算样品无机磷浓度y（μmol/mL）。
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1 μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。
GCL(U/mg prot)=(y×V反总)÷(Cpr×V样)÷T=0.54×y÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：37℃下，每克样品每分钟催化产生1 μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。
GCL(U/g 鲜重)=(y×V反总)÷(W÷V样总×V样)÷T=0.54×y÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每104个细胞每分钟催化产生1 μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(U/104 cell)=(y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=1.08×10-3×y
（4）按血清（浆）等液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生1 μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL(U/mL)=(y×V反总)÷V样÷T=0.54×y
V反总：反应总体积，0.196 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；V样：加入样品体积，0.024 mL；T：反应时间，15 min；W：样品鲜重，g；V样总：加入提取液的体积，1 mL；500：细菌或细胞总数，500 万
更新中...
答：可能的原因有：
1、胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀；
2、某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致；
3、缓冲液陈旧，成分改变,可以重配；
4、凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走；
5、电泳时温度过高，可以降低电流或电压；
6、样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀。
Copyright ©湖北普美生物科技有限公司 All Rights Reserved. 工信部备案：鄂ICP备17001029号-1 技术支持：武汉微盟
