γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)是γ-谷氨酰循环中的关键酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体,也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，产生谷氨酸盐，在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、细胞、细菌样本中γ-GT的活性。原理是γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸，生成对硝基苯胺，在405 nm有特征光吸收；通过测定405 nm光吸收增加速率，来计算γ-GT酶活性。

酶标仪或可见分光光度计（能测405 nm处的吸光度）及水浴锅

96 孔板或微量玻璃比色皿、低温离心机、制冰机

可调节式移液枪及枪头

去离子水

匀浆器（如果是组织样本）

提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

工作液：临用前配制；将试剂二加入试剂一充分溶解（室温过低时可以40℃水浴促进溶解）；然后将试剂三加入试剂一瓶中；4℃保存。

样本制备

组织样本：称取约0.1 g组织，加入1 mL 提取液，进行冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心15 min，取上清，置冰上待测。

细胞、细菌：收集500万细菌或细胞加入1 mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞3 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s）；然后8,000 g，4℃，离心15 min，取上清，置于冰上待测。

血清（浆）等液体：直接测定。

注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。

2. 细胞中γ-GT活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中γ-GT的提取时可加提取液后超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞（防止因为蛋白质变性导致酶失活）。

3. 如需要进行样本蛋白质浓度测定时，推荐用BCA法蛋白质定量试剂盒。

1. 酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到405 nm，可见分光光度计去离子水调零。

2. 工作液置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min以上（保证无沉淀）。

3. 样本测定：在96 孔板或微量玻璃比色皿中  依次加入20μL样本，180μL工作液，

迅速混匀后于405 nm处测定10s和70s时的吸光度，记为A₁，A₂计算ΔA=A₂-A₁。

注意：1. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量；如果ΔA大于0.5样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。

3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。

A. 使用96孔板测定的计算公式

1. 按蛋白浓度计算

活性单位（U）定义：25℃或37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/mg prot)=[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V_样)÷T=2026×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

活性单位（U）定义：25℃或37℃中，每克组织每分钟催化产生1nmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/g 鲜重)=[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V _样总×V_样)÷T=2026×ΔA÷W

3. 按血清（浆）计算：

活性单位（U）定义：25℃或37℃中，每毫升血清每分钟催化产生1nmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/mL)=[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷V_样÷T =2026×ΔA

4. 按细菌或培养细胞计算：

单位的定义：25℃或37℃中，每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/10⁴ cells)=[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500÷V _样总×V_样)÷T= 4.053×ΔA

V _样：加入样品体积，0.02 mL； V _样总：加入提取液体积，1 mL；V_反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；T：反应时间，1 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500：500万细胞； ε：对硝基苯胺消光系数，9870 L/mol/cm； d：比色皿光径， 0.5 cm；10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹ nmol。

B. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm 调整为 d：1 cm 进行计算即可。