NADPH 氧化酶（NAO）广泛存在于动物、植物和真菌中，是一个典型的膜蛋白，催化NADPH氧化生成NADP+，并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。该酶异常可导致人慢性肉芽肿病（GCD），在植物中，该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中NADPH 氧化酶（NAO）的活性水平。其原理是NADPH 氧化酶（NAO）将 NADPH氧化为NADP+，NADPH在340nm有特征吸收峰，而 NADP+没有；通过测定 340nm吸光度减少的速率来计算得出NAO酶活性大小。

酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

恒温箱、制冰机、低温离心机

去离子水

匀浆器（如果是组织样本）

提取液：即用型；4℃保存。

反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂一：临用前配制；用前96T加入5mL去离子水，48T加入2.5mL去离子水，未用完试剂分装-20℃保存，实验时冰上放置，避免反复冻融。

动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL预冷的提取液，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

细胞：收集5×10⁶个细胞，用冷PBS清洗细胞后弃上清，加入1mL预冷的提取液冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。12,000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。

血清、血浆等液体样本：可直接测定，根据预实验确定稀释倍数。

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

1．酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，可见分光光度计去离子水调零。

2．反应缓冲液置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热15min。

3．样本测定：在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10μL样本，150μL反应缓冲液和40μL试剂一。充分混匀，记录340nm处1min 20s时吸光值A₁，迅速放入25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）恒温箱中，准确反应 5min。迅速取出记录6min 20s时的吸光度 A₂。计算ΔA=A₁-A₂。

注意：1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可延长反应时间T（如至10min或更长），或适当加大样本量；注意对计算公式进行调整。如果ΔA大于1.0，可用提取液稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。

3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。

NAO活力单位的计算

A. 使用96孔板测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算

活力单位定义：一定条件下，每g样品在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

6PGDH（U/g 鲜重）=[△A×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_样总×W)÷T=1286×ΔA÷W

2. 按液体体积计算

活性单位定义：一定条件下，每mL液体样本在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。6PGDH(U/mL)=[△A×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷V_样÷T=1286×ΔA

3. 按细胞数量计算

活力单位定义：一定条件下，每10⁴个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

6PGDH(U/10⁴ Cells)=[△A×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V_样÷V_样总)÷T=1286×△A÷500=2.572×△A

（4）按蛋白浓度计算

活力单位定义：一定条件下，每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。

6PGDH(U/mg prot)=[△A×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V_样)÷T=1286×△A÷Cpr

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V_反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V_样：加入反应体系中样本体积，10μL =0.01mL；V_样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，5min；500：细胞数量，500万。

B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。