蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据适pH，Ivr 分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。AI的适pH为3～5。AI分为可溶性AI(S-AI)和细胞壁不溶性AI（B-AI）两种类型。S-AI主要存在于细胞液泡或自由空间中，适 pH 为4.5~5.0（酸性），通过降解液泡中蔗糖，调节液泡中蔗糖的利用和果实内糖类的积累。本试剂盒提供了一种检测S-AI活性的便捷方法，其原理是S-AI催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm有特征光吸收，在一定范围内540nm光吸收增加速率与S-AI活性成正比。测定540nm吸光度的变化可计算S-AI活力。

酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）

水浴锅、制冰机、低温离心机

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

去离子水

匀浆器

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

提取液: 即用型；4℃保存。

试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂二: 临用前48T加入5mL试剂一，96T加入10mL试剂一充分溶解待用；用不完的试剂可4℃保存一周或分装-20长期保存。

试剂三: 即用型；常温避光保存，若有黄色晶体析出，需 90℃加热溶解后再用。

标准品：含10 mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或分装-20℃长期保存。

标准曲线设置：按下表所示，用去离子水将10mg/mL标准品稀释为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313mg/mL 的标准溶液。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品。

样本制备

组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。

2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：

混匀，95℃水浴10min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀，吸取200μL于96孔板或者微量比 色皿中，测定540nm 处各管的吸光值，空白孔记为A_空，标准孔记为A_标，测定孔记为A_测，对照孔记为A_对。计算ΔA_测=A_测-A_对，ΔA_标=A_标-A_空。标准曲线和空白管只要测定一次，每个测定管需要设一个对照管。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA_测小于0.001可适当加大样本量。如果A_测大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

1. 标准曲线的绘制：

以标准溶液浓度为y轴，ΔA_标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。

将ΔA_测带入方程得到 y（mg/mL）。

2. S-AI酶活性计算

（1）按照样本鲜重计算

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化蔗糖水解生成1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

S-AI酶活（U/g 质量）=y×V_反总×10³÷(V_样÷V_样总×W)÷T=166.67y÷W

（2）按照蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化蔗糖水解生成1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

S-AI酶活（U/mg prot）=y×V_反总×10³÷(V_样×Cpr)÷T=166.67y÷Cpr

V_反总：反应总体积，0.25mL；V_样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V_样总：加入提取液体积，1mL；10³：单位换算系数，1mg=10³µg；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T ：反应时间：30min。

典型标准曲线