OCT包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物,目前已广泛用于免疫组化实验室中,其用途是在冰冻切片时支撑组织,以增加组织的连续性,减少皱折及碎裂。又因OCT混合物为水溶性,故在漂片时可溶于水,所以在以后的染色中不会增加背景染色。利用OCT混合物预先浸润组织,然后再进行恒冷箱切片,使切片质量得到改善。
1、将放在蔗糖溶液中的组织块取出,放入20g L-1蔗糖与OCT包埋剂1:1体积比例混合液中,室温浸泡2h。
2、移入OCT包埋剂中室温浸泡4h,更换新的OCT包埋剂,室温浸泡6h。
3、将标本置于托物台,用恒冷箱切片机切片(一般-22℃),片厚10μm,贴于预处理的载玻片上,-20℃冰箱保存。
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多个修饰位点,本身可以呈现多条带,建议查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小;
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作;
3、杂蛋白多,建议处理目的蛋白;
4、抗体特异性不强,建议使用特异性强的抗体;
5、抗体孵育时间过久,建议减少抗体孵育时间;
6、二抗与抗原有交叉反应,建议选择合适的封闭物;
7、二聚体或多聚体存在,建议增加蛋白质变性过程及强度;
8、底物显色与曝光时间过长,建议缩短显色及曝光的时间。
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