非还原SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5*Non-Reducing SDS-PAGE Sample Loading Buffer)是一种经过改良的以溴酚蓝为染料,5倍浓缩的蛋白上样缓冲液。本产品含SDS等变性试剂,不含DTT、巯基乙醇等还原性试剂,可以用于常规的SDS-PAGE 蛋白样品的上样。
1、在室温或不超过 37℃的水浴中溶解蛋白上样缓冲液(5X),水浴溶解后立即室温存放,尽量避免长时间 置于水浴中。
2、按照每4ul 蛋白样品加入1ul 蛋白上样缓冲液(5X)的比例,混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液 (5X)。
3、100℃金属浴或沸水浴加热 5-10 分钟,以充分变性蛋白。
4、冷却到室温后,直接上样到 SDS-PAGE 胶加样孔内即可。
5、通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
1、蛋白上样缓冲液(5X)必须完全溶解后再使用。
2、本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
3、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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答:如果能够排除下面的几个问题,那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
1、二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光;
2、ECL底物中H2O2不稳定,失活;
3、ECL底物没覆盖到相应位置;
4、一抗选择不当;
5、二抗失活。
答:可能的原因有:
1、膜没有完全均匀湿透,建议 使用100% methanol浸透膜;
2、洗膜不充分,可以增加洗液体积和洗涤次数;
3、电极不平衡或者加样位置偏斜,可以调整电极和加样;
4、封闭物用量不足,可以提高封闭物浓度,孵育时保证封闭液完全浸没转印膜;
5、封闭物使用不当,比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭;
6、封闭时间不够,一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜;
7、抗体非特异性结合,可以降低抗体浓度,减少孵育时间;
8、一抗稀释度不适宜,可以对抗体进行滴度测试,选择适宜的抗体稀释度;
9、一抗孵育的温度偏高,建议4℃结合过夜;
10、抗体浓度过高或洗涤不够,建议降低抗体浓度,增加洗涤次数和时间;
11、化学显色底物过多,建议按说明书加入适量的显色底物。
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