苏木素(Hematoylin)和伊红(Eosin)联合染色简称HE染色,是病理学和组织学常用的一种染色方法,苏木精为碱性天然染料,可使细胞核着色;细胞核内染色质的主要成分是 DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。
改良Mayer苏木素染色液无毒,无氧化膜,细胞核染色质着色深而细微,临床上常替代Harris苏木素染色液;对细胞核染色很清晰,不着染胞质和纤维成分,属进行性染色故染色后可以不用盐酸乙醇分化染色时间约5-8min ,如果是充分氧化后可染色3-5min。该试剂常用于糖原等特染、酶组化和免疫组化等染色后复染细胞核作对照染色,尤其适用于经过特殊染色后不能经酸处理时对细胞核的复染,在特殊染色中常与天青石蓝B液联合染色,使细胞核染色后不被后续的酸性染料所褪色。该试剂仅用于科研领域,不适用于临床诊断或其他用途。
(一)石蜡切片染色
1、切片脱蜡至水
①二甲苯或浸蜡脱蜡透明液作用2次,每次5 ~ 10min。
②(可选)无水乙醇作用2次,每次3~ 5min.
③95%乙醇3 ~ 5min
④90%乙醇3 ~ 5min
⑤80%乙醇3 ~ 5min
⑥自来水或蒸馏水(亦可用30~ 40°C温水)冲洗1 ~ 3min
2、染色
①改良Mayer苏木素染色液5~ 8min
②自来水或蒸馏水冲洗5~ 10s
③(可选)盐酸乙醇分化2~ 5s
④自来水冲洗20~ 30s
⑤蓝化液或温水返蓝20~ 40s
⑥80%乙醇脱水30 ~ 60s
⑦伊红染色液(醇溶)染色30s ~ 3min
3、脱水、透明、封固
①80%乙醇10 ~ 20s
②90%乙醇10~ 20s
③95%乙醇作用2次,每次1 ~ 2min。
④无水乙醇作用2次,每次2~ 3min。
⑤二甲苯或浸蜡脱蜡透明液透明3次,每次2 ~ 3min。
⑥中性树胶封片。
(二)冰冻切片染色
1、乙醚-乙醇混合固定液5~ 10s
2、自来水冲洗2~ 5s
3、苏木素染色液滴染1 ~ 2min(可加热至50°C)。
4、自来水冲洗2~ 5s
5、(可选)盐酸乙醇分化2~ 5s
6、自来水冲洗2~5s
7、蓝化液或温水返蓝2~ 5s
8、80%乙醇脱水5~ 10s
9、伊红染色液(醇溶)染色2~ 5s
10、80%乙醇1~ 2s
11、95%乙醇1~ 2s
12、无水乙醇2~ 5s
13、苯酚二甲苯(1:3)2~ 5s
14、二甲苯或浸蜡脱蜡透明液透明3次,每次2~ 5s。15、中性树胶封片。
(三)细胞染色
1、4%多聚甲醛固定10 ~ 20min.
2、自来水冲洗2次,每次2min。
3、蒸馏水冲洗2次,每次2min。
4、染色、脱蜡、透明、封固步骤同石蜡切片的染色步骤,作用时间应相应缩短。
1.切片脱蜡应尽量干净。
2.系列乙醇应经常更换新液。
3.盐酸乙醇分化时间应根据切片厚薄、组织类别以及新旧而定,另外分化后自来水冲洗时间应该足够,以便彻底清洗酸。
4.乙醚-乙醇混合固定液是由乙醚和95%乙醇等量混合而得, 再加入适量乙酸,密闭保存。
5.冷冻切片染色时间尽量要短。
6.蓝化液常使用0.2-1%氨水或Scott促蓝液或0.1-1%碳酸锂溶液。
7.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴-次性手套操作。
8.本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多个修饰位点,本身可以呈现多条带,建议查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小;
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作;
3、杂蛋白多,建议处理目的蛋白;
4、抗体特异性不强,建议使用特异性强的抗体;
5、抗体孵育时间过久,建议减少抗体孵育时间;
6、二抗与抗原有交叉反应,建议选择合适的封闭物;
7、二聚体或多聚体存在,建议增加蛋白质变性过程及强度;
8、底物显色与曝光时间过长,建议缩短显色及曝光的时间。
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