超氧化歧化酶D-虫荧光素（D-Luciferin）是萤火虫荧光素酶底物，其量子效率为0.88。反应原理：首先，在镁离子存在下荧光素酶使荧光素与ATP反应，接着它被氧化形成二氧杂环丁烷结构并发出黄绿色的光。Luciferin-luciferase发光用于ATP监控以测定细胞活力以及细菌计数。它还用于报告基因检测。可与小动物活体成像系统配套使用，用于标记LUC基因后的体内活体荧光检测。
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1、一抗/二抗浓度可能过高；
2、内源性过氧化物酶具有活性；
3、使用与染色组织相同种属来源的一抗（例如在小鼠组织上使用小鼠一抗）。应用二抗时，由于二抗是靶向组织种属的，与组织中的免疫球蛋白或蛋白的Fc片段结合；
4、切片/细胞已干燥；
5、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色；
6、非特异性组分与抗体结合。
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