作者开发了一种空间可编程的人工金属酶（ArMs）系统，可将钯（Pd）催化的生物正交反应精准定位于细胞膜或细胞质。该系统由生物素化钯辅因子、链霉亲和素（SAV）支架和生物素化脂质锚定剂组成，利用脂质锚定或脂质体递送实现定位控制。优化后的Pd辅因子可在高硫醇环境中高效催化Alloc脱保护，SAV突变体（S112A/K121R）使活性提升3.5倍。实验表明，该系统可同时在膜和胞质进行双位点催化，并通过脂质体递送实现肿瘤靶向和前药激活，显著增强抗癌效果。

生物正交化学可在不干扰生命系统的前提下实现选择性化学转化，其中钯（Pd）催化剂因其多功能性和生物相容性成为细胞内应用的理想选择。然而，Pd在活细胞中面临溶解性差、潜在毒性、定位困难和细胞内硫醇失活等挑战。受天然金属酶启发，人工金属酶（ArMs）通过将金属中心嵌入蛋白支架（如链霉亲和素SAV）来模拟天然酶的高效与稳定性，实现非天然催化功能。尽管ArMs在体外验证中展现出潜力，但仍存在金属辅因子组装难、细胞内活性维持难和靶向递送难等瓶颈。作者构建了一个专为细胞水平设计的ArMs平台，利用链霉亲和素–生物素系统高效固定生物素化Pd辅因子，借助蛋白支架保护Pd中心免受细胞内抑制剂影响，从而提升催化效率，实现精准、可控的生物正交催化。

作者设计并合成了四种新型烯烃-钯-三苯基膦配合物（Pd1a–Pd4a），系统评估其对荧光底物Alloc-RhB和 Proc-RhB的脱保护活性。结果表明，Alloc 脱保护远优于Proc脱保护；其中 Pd1a 在含谷胱甘肽的生理条件下表现强（10 mol % Pd，2小时44.3 % 转化）。机理研究显示，在强亲核环境（如GSH）中，反应速率由底物-钯配合物的亲核加成/氧化加成控制；而在弱亲核条件下，亲核试剂介导的还原消除成为限速步骤。重要的是，Pd1a在复杂细胞裂解液中仍保持高活性，显示其优异的生物相容性和细胞内应用潜力。

作者合成了系列不同连接臂长度的生物素化钯复合物（Pd1b–Pd4c），经生物素–链霉亲和素（SAV）组装得到人工金属酶（SAV-Pd）。SAV 四聚体在高浓度谷胱甘肽中结构稳定，所得 SAV-Pd在生理培养基和细胞裂解液中均保持催化活性。筛选结果显示 Pd1b-SAV 与 Pd1c-SAV 活性与游离辅因子相当；进一步对催化热点残基S112和K121实施点突变，单突变S112A使 Pd1b-SAV 活性提升 2 倍，而双突变S112A/K121R（SAVAR）将活性提高3.5倍，终选定 Pd1b-SAVAR用于后续细胞实验。

作者开发了一种用于人工金属酶(ArMs)的脂质锚定系统：借鉴GPI锚定机制，将生物素化脂质锚与突变优化的SAVAR-Pd1b组装后，快速并稳定地锚定在细胞膜上，且具有良好的生物相容性。将高灵敏度的Alloc-caged T3前药与膜锚定ArMs共孵育，仅需2 μM SAVAR和4 μM Pd1b即可在基因开关转染的HeLa细胞中触发强烈萤火虫素酶信号；缺失脂质锚定的对照组无显著发光，证明了膜锚定对实现高效、局部生物正交催化的关键作用。

作者通过阳离子脂质体（DOTAP:DOPE:Chol=1:1:1）将脂质化ArMs（s/dOle-SAVAR）高效载入（sOle插入率85.7%，dOle 41.6%），形成SAVAR@Lip。该脂质体粒径、电位及TEM均证实结构完整；共聚焦显示其经溶酶体后逃逸至胞质，ICP-MS证实胞内Pd含量显著提升。功能上，经sOle-SAV^AR-Pd@Lip处理的细胞加入Alloc-RhB后，胞内出现强烈荧光，而无脂质体封装组无信号，证明脂质体递送实现了高效的细胞内生物正交催化。

作者通过设计“On/In-Cell”双底物系统，实现了细胞膜与胞质的同步可控催化：利用脂质体递送的In-Cell ArMs在胞内激活透膜底物Alloc-RhB（绿色荧光产物），随后以膜锚定的 On-Cell ArMs在胞外催化非透膜负电底物Alloc-CQ-SO₃⁻（蓝色荧光产物）。共聚焦成像显示，蓝色荧光仅出现于细胞外基质，绿色荧光仅局限于胞质，唯有同时启动两套系统时，两种信号方能在同一细胞内并存，从而精确验证了分区催化的空间定位能力。

作者以阿霉素前药Alloc-DOX（体外毒性比游离DOX低100倍以上）为模型，证实On/In-Cell ArMs体系可在体外显著提升其细胞毒性，且联合系统杀伤效果优于游离DOX。体内4T1荷瘤小鼠实验表明，脂质体递送使ArMs在肿瘤富集，仅“ArMs+Alloc-DOX”组（20或40 μmol/kg）实现显著抑瘤，高剂量几乎抑制肿瘤且无明显毒性，而低剂量游离DOX已导致体重下降及肝酶升高；组织学亦显示ArMs组肿瘤广泛坏死而主要脏器无损，充分证明了局部前药激活的高效性与安全性。

该研究构建了可精准定位的ArMs平台，突破传统ArM空间限制，实现膜/胞质双位点催化，并通过脂质体递送解决体内应用难题，为靶向癌症治疗和精准化学生物学提供新范式。