Part.01

如何选择裂解液

Part.02

提取的时候是否需要加蛋白酶抑制剂？

    蛋白酶抑制剂是维持样本完整性的关键组分，防止蛋白在提取及后续保存过程中发生降解。目前很多商家都在裂解液中添加蛋白抑制剂，可以即开即用。蛋白酶抑制剂的选择主要取决于目标蛋白可能会被降解的酶的种类，常用的抑制剂是PMSF，可抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶。在实验过程中还会加入蛋白酶抑制剂，如果目标蛋白是磷酸化的蛋白，还需要额外再加磷酸化蛋白酶抑制剂。

    蛋白酶抑制剂（100X）需要以1%体积比添加入裂解液中，即1mL裂解液需要加入10uL蛋白酶抑制剂（具体参照相应产品的使用说明）。由于部分抑制剂（如PMSF）在水溶液中稳定性较低，建议现用现配：在样本裂解前5-10分钟内完成抑制剂与裂解液的混合配制，以确保佳保护效果。

Part.03

提取的时候应该加多少裂解液？

 细胞样本：一般建议1-2X10⁶细胞（即六孔板细胞密度70%左右）使用裂解液体积为200uL左右，如果需要的蛋白浓度较高，则可以根据裂解液效果适当减少裂解液用量，如先加入100uL裂解液吹打裂解，如果发现样本裂解不充分，如裂解物粘稠、胶冻样或有明显细胞团块则少量多次补加裂解液进行吹打裂解，直至裂解物呈现比较好的线性流动状态，可以在裂解充分的同时保证蛋白浓度。

组织样本：常规组织（如心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉组织、脑组织等）建议裂解液体积使用体积与样本量为10:1，如20mg组织样本，使用裂解液量为200uL左右。一些特殊组织（如骨膜、筋膜、软骨等）蛋白含量较低、质地坚硬、裂解难度较大的样本，一般建议裂解前尽量破碎处理组织（推荐液氮研磨成细粉），之后根据组织特性按照1:5-1:10加入裂解液进行裂解提取。

Part.04

血清、血浆、细胞培养上清等液体样本的蛋白应该如何提取？

    液体样本中的蛋白质多数以可溶性蛋白的形式溶解于样本内，对于这一类样本的蛋白获取严格来讲不叫提取，而应该称之为收集浓缩。常用的方法是透析、或超滤浓缩。可以根据目标蛋白的大小选择合适透析膜或超滤浓缩管去除不需要的液体成分和蛋白，针对性的浓缩收集目标蛋白。

    对于血液含量较多的样本建议取样后先用PBS漂洗2-3次，去除样本表面的血液。之后将样本尽可能用剪刀剪碎加入红细胞裂解液（产品货号：PMK0011），多次反复裂解去除红细胞及血色素后再按照正常提取流程进行蛋白提取。

Part.05

提取的蛋白应该如何保存？应该变性前低温保存还是变性后再保存？

   常用的蛋白保存温度为-20℃或-80℃。-20℃可较好地保护蛋白质的活性和稳定性。在这种温度下，蛋白质提取液可以较长时间保存，一般能保持数月至一年左右的稳定性。-80℃蛋白质的降解和变性速度更慢，可以更长时间地保持蛋白质的完整性和活性，可以长期保持数年至十年的稳定性。需要注意的是保存蛋白质提取液时，应避免频繁的温度波动和反复冻融，这可能会对蛋白质的稳定性产生不利影响。

      对于蛋白变性前保存还是变性后保存一般并没有明确的要求或资料支持。两种情况都可以冻存。一般建议变性后按使用量分装冻存，避免反复冻融。