细胞培养基的种类

细胞培养基大致可分为平衡盐溶液、天然细胞培养基、合成细胞培养基、无血清细胞培养基、几大种类。

1.1 平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）

BSS主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于细胞的漂洗、配制其他试剂等。常用的平衡盐溶液有：PBS、D-Hank's、Hank's。

1.2 天然细胞培养基

天然培养基指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液等。目前用于细胞培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质可促进细胞生长，但血清中的补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。血清的优点是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是成分复杂，来源受限且制作过程复杂、批间差异大。因此，血清作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5 ~ 20 %，常用是10 %。

1.3 合成细胞培养基

合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。早开发的基础培养基（minimal essential medium, MEM），是含有盐、氨基酸、维生素和其他必需营养物的pH缓冲的等渗溶液。有些天然培养基的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用合成培养基时必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。普遍的做法是添加5 ~ 20 %的血清，这样才能维持细胞活力，促进细胞增殖，并且减少了血清等动物来源成份对细胞安全性的影响。

1.4 无血清细胞培养基（serum free medium，SFM）

经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。无血清培养基，一般是在合成培养基的基础上，加入成份完全明确的或部分明确的血清替代成份，达到既能满足动物细胞培养的要求，又能有效克服使用血清所带来问题。

培养基的基本组分

细胞培养基的主要成份是水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助营养物质等。此外，还可能含有血清、血清替代成分、pH指示剂等。

2.1 水

水是细胞的主要成份，也是细胞赖以生存的主要环境。细胞对水的品质非常敏感，水的品质将直接影响细胞培养的效果。细胞培养用水须经过纯化，品质应符合中国药典注射用水标准或者超纯水的标准。

2.2 能源和碳源

能源和碳源是用于维持细胞生命和支持细胞生长，主要包括糖、糖酵解的产物和谷氨酰胺，其他氨基酸是次要的能源和碳源物质。细胞能够利用的糖类主要是六碳糖，目前大多体外培养时选取葡萄糖作为细胞的主要碳源和能量来源，因此细胞培养基中基本都含有葡萄糖，含量一般为5～25 mmol/L。

2.3 氨基酸

氨基酸在细胞内的重要生理作用主要体现在以下几个方面：

① 是蛋白质的基本组成单位，用于合成蛋白质和多肽；

② 可用于合成某些具有重要生理作用的含氮化合物，如核酸、尼克酰胺等；

③ 某些氨基酸还具有独特的生理作用，如甘氨酸参与生物转化作用，丙氨酸和谷氨酰胺参与细胞内氨的运输等；

④ 可转变成糖类和脂肪，参与氧化供能。

不同的细胞对氨基酸的需求各异，但有些必需氨基酸是细胞不能自身合成的，必须依靠外源的细胞培养液提供。

2.4 维生素

维生素是维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。维生素可分为水溶性和脂溶性两类，水溶性维生素主要包括泛酸、维生素B12、叶酸、烟酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黄素、维生素C、胆碱、肌醇等；脂溶性维生素主要包括维生素A、D、 E、K等；有的培养液中还直接采用ATP和辅酶A；大部分培养基中还有生物素。许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。比如，泛酸可以在细胞内转变成酰基载体蛋白和辅酶（如辅酶A），参与糖类、脂类和蛋白质代谢中的催化反应；维生素B12则在细胞内参与叶酸的合成和脂肪酸的合成等。

2.5 无机盐

无机盐是细胞维持生命活动所不可缺少的营养成分，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl－、PO43—、SO42—、HCO3－等，主要作用为维持细胞培养液渗透压平衡，参与细胞的代谢活动。上述离子对于细胞的作用各有不同，它们共同构成了细胞赖以生存的渗透压、pH和电化学平衡的微环境。因此，在保证培养基中上述离子浓度满足要求以外，还需保证上述离子之间种类和比例的平衡。

2.6 其他添加成分

在低血清、无血清细胞培养基中，为满足细胞生长增殖需要，常常添加一些成份：蛋白质、多肽、核苷、嘌呤、柠檬酸循环的中间产物、脂类、及一些血清替代因子等。另外，酚红常作为pH值的指示剂被加入到细胞培养基中。

细胞培养基的理化性质

动物细胞在细胞培养基中不仅能存活，还要分裂增殖，合适的渗透压、pH值等理化性质是细胞培养基必须具备的前提条件。

3.1 pH

动物细胞适宜的pH在7.2～7.4之间。细胞培养基中常用酚红作为pH指示剂，在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，pH值发生变化，溶液由红色变为黄色，提醒实验人员更换培养液。

3.2 缓冲能力

 细胞培养过程中细胞代谢产生的CO2在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，细胞培养液pH很快下降；打开。培养器具时CO2逸出则会引起pH升高。细胞培养基通常采用NaHCO3-CO2缓冲系统，此外，还有缓冲能力较高的磷酸盐缓冲系统。碳酸盐缓冲系统的细胞毒性小、成本低，在细胞培养中应用得更为广泛。另一种较为常用的缓冲液是HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）液，它是一种非离子两性缓冲液，在pH 7.0 ~ 7.2范围内具有较好的缓冲能力。但高浓度的HEPES可能对细胞有毒性作用，细胞培养时HEPES的添加浓度一般为10～25 mmol/L。

3.3 渗透压

细胞必须生活在等渗的环境中，大多数体外培养的细胞对渗透压有一定耐受性。研究显示，对于大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260～320 mOsm/kg的范围内都适宜。在生产、配制细胞培养基的过程中，渗透压的测定较为重要，有助于防止在生产、配制过程中出现称量等方面的错误。反应器高密度培养动物细胞过程，在添加碳酸氢钠的过程中注意渗透压的监控，防止渗透压过高对细胞的损害。

3.4 温度

温度对细胞培养基有较大的影响，温度过高可引起营养成份的降解或破坏，细胞培养基的pH、离子强度和电解常数pKa也可能受到影响。如细胞培养液中的谷氨酰胺，在高温条件下降解的速度较快。

3.5 粘滞性及表面张力

含血清细胞培养液的粘滞性主要是由血清引起的，在转瓶培养贴壁细胞时，培养液的粘滞性对细胞生长没有多大影响；但在生物反应器悬浮培养细胞时，细胞培养液的粘滞性则直接影响搅拌转速控制及搅拌剪切力对细胞造成的损伤程度。

表面张力对细胞培养有较大的作用，尤其在利用生物反应器进行悬浮培养时，搅拌和通气都会引起泡沫的产生。对于含血清培养液，由于血清中多种蛋白的存在，搅拌时产生的气泡较多，气泡的上升运动对细胞的损伤程度还有争议，但气泡的破裂对细胞有明显的损伤作用。为降低这种损伤，可通过在细胞培养基中添加一些保护剂，降低细胞-气体和细胞-液体的表面张力，减少气泡的形成。

细胞培养基使用过程中的注意事项

4.1培养基的储存

液体细胞培养基需要2 ~ 8 ℃避光保存，使用前从冰箱取出，放入室温进行平衡。避免-20 ℃冻存，因为解冻时可能会有营养成份析出，影响培养效果。液体培养基有效期是6个月到12个月，尽量避免长期贮存，谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解，如果细胞生长不良，可考虑检测培养基中的谷氨酰胺含量确定是否再补加谷氨酰胺。培养基中除谷氨酰胺易降解之外，培养基中的其他成份也可能随着温度的改变会发生降解或析出。

4.2 细胞培养基的成分改变

（1）酚红在细胞培养基中用作pH值的指示剂。一般情况下，可以通过酚红的指示作用判断培养基的pH值，但低血清或是无血清细胞培养基中酚红的含量与普通细胞培养基中的酚红含量不同，不能通过肉眼观察或通过经验来判定pH值，建议使用pH计进行测定。

（2）谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4 ℃下放置1周可分解50 %，使用中好单独配制，置-20 ℃冰箱中保存，使用前加入细胞培养液中。

（3）细胞培养过程中pH值下降产生的原因有很多。在细胞生长非常快时，pH值通常下降得很快，此时可以通过及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得过紧、NaHCO3缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。