随着温度降低，细胞内的酶活性会逐渐降低，到-70℃左右，酶活性几乎为0，代谢活动停止，可以实现长期保存。然而，随着温度降低，细胞内外的水分也会“结冰”并形成冰晶，冰晶能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。因此常加入冷冻保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

实验步骤

1. 细胞冻存液配置：冻存液配置比例根据实验习惯即可，建议一次少量配置，配置完成后，由于DMSO的存在，因此需要严格避光保存。

2.镜下观察细胞，当细胞密度满足要求后，弃掉原有培养基，沿培养皿边缘加入1mlPBS缓冲液进行清洗。

3.弃掉PBS缓冲液，加入胰酶消化细胞，消化时间根据细胞类型决定。

4.消化到时间后，加入二倍胰酶体积的培养基终止消化，用移液器将细胞全部吹下，转移至离心管内。

5.离心机常温800rpm，离心5min。

6.弃上清，加入1ml配置好的冻存液，用移液器轻轻吹打10-15次混匀。

7.冻存管标记好相应信息，包括细胞名称、代数、冻存时间、操作者姓名等，将上述混悬液全部转移至冻存管内，拧紧冻存管管口，放入程序降温盒内。

8.将程序降温盒放入-80℃冰箱内，36h后可从程序降温盒内拿出细胞放在细胞冻存架上保存。

（1）培养基:血清:DMSO=7:2:1

适用于大多数细胞系，能够保证细胞在冻存过程中有较高的存活率。

（2）血清:DMSO=9:1

适用范围：适用于需要长时间保存或者具有特别珍贵性的细胞系。血清含量高，可以更好地保护细胞，并确保其在冻存后依然保持较好的生物学特性。

（3）无血清冻存液：适用于某些对血清敏感或需要避免血清成分的细胞系。配置比例：如10% DMSO+90%专用无血清培养基，或其他适合细胞生长的无血清替代品。

     推荐使用普美生产的无血清细胞冻存液，适用于绝大部分的哺乳动物细胞冻存。不含常用的胎牛血清(FBS) 、不含任何动物来源)的蛋白质，能减少细胞污染风险，确保细胞安全；而且使用本无血清细胞冻存液，可直接置于-80℃长期保存，无须程序性降温，使用非常便捷。

注意事项

1.在冻存管上标记信息时使用一支质量较好的马克笔，保证在后期进行细胞复苏时信息不会被水或酒精洗掉。

2.细胞冻存时应确保细胞处于对数生长期，形态正常，无污染。且细胞冻存数量要多，密度≥90%。

3.细胞冻存原则为“慢冻”，因此，细胞加入冻存管后如何保存应严格遵守冻存流程，避免冻存太快，产生结晶。

4.二甲基亚砜（DMSO）是一种细胞保护剂，在深低温情况下可防止细胞内形成冰晶，减少细胞损伤，因此冻存液配置中DMSO必不可少，但可以改变血清的比例，对于一些原代细胞或较为重要的细胞，可将血清比例提高至50%-90%，保证其有较高的存活率。

5.细胞混悬液加入冻存管后，不宜在常温放置过久，因此应先将细胞冻存盒放入冰箱，再进行后续相关实验。

6.不要将DMSO直接加入含有细胞的培养基中，因为DMSO溶于培养基时会释放大量热量，可能烫伤细胞。在加入细胞前，可以将配置好的冻存液放于4℃进行预冷。DMSO在4°C时毒性会大大减弱，且渗透速度加快，有助于保护细胞。

7.使用冻存盒进行冻存时，必须将冻存盒解冻至室温（避免温度骤变对细胞的损伤）。如果直接将冷冻的冻存盒从低温环境取出，并立即打开或处理，细胞会受到温度骤变的影响。温度的急剧上升可能导致细胞内冰晶的形成或扩大，对细胞膜和细胞器造成机械性损伤，进而影响细胞的存活率。

END