目前世界上常用的蛋白浓度检测方法是:BCA 蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)。Bradford法与传统方法相比,更简单、更稳定、兼容性更好。
Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中β-巯基乙醇的浓度可高达1M,DTT的浓度可高达5mM。但受高浓度的去垢剂的影响明显,故在用Bradford蛋白定量试剂盒进行蛋白定量时,需确保SDS低于0.01%,Triton X-100低于0.05%,Tween20,60,80低于0.015%。含高浓度去污剂的蛋白定量,建议采用BCA蛋白定量试剂盒。
Bradford蛋白定量试剂盒主要由G250、缓冲液等组成,检测速度很快,少量样品一般只需10min即可完成检测。检测浓度下限达到25ug/ml,小检测蛋白量达到0.5ug,待测样品体积为1~20ul。在50~1000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
1、考马斯亮蓝G250溶液使用前请颠倒3-5次,混匀。
2、蛋白标准请在全部溶解后先混匀,再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准品。
3、将考马斯亮蓝G250溶液回复到室温再使用,有利于提高检测的灵敏。
4、Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中β巯基乙醇的浓度可高达1M,二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.01%,TritonX-100低于0.05%,Tween20,60,80低于0.015%。含去垢剂的样品推荐使用本公司生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(PMK0442)。染色时间不能太长,否则活细胞会因染料积累而染成颜色,使检测结果偏低。
5、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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答:可能的原因有:
1、目的蛋白有多个修饰位点,本身可以呈现多条带,建议查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小;
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作;
3、杂蛋白多,建议处理目的蛋白;
4、抗体特异性不强,建议使用特异性强的抗体;
5、抗体孵育时间过久,建议减少抗体孵育时间;
6、二抗与抗原有交叉反应,建议选择合适的封闭物;
7、二聚体或多聚体存在,建议增加蛋白质变性过程及强度;
8、底物显色与曝光时间过长,建议缩短显色及曝光的时间。
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