产品简介

ROS活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针H2DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。H2DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。根据活细胞中荧光的产生，可以判断细胞活性氧的含量和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种经典的组织或活细胞中活性氧检测方法。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物，浓度为50mg/mL。Rosup 为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正水平。

本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

本试剂盒可以测定1000个样品（以96孔板为标准）。

产品内容

操作步骤：

一. 装载ROS 探针

1. 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)

a) 细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞数量小于5×10⁵/ml。

b) 药物诱导：去除细胞培养液，加入无血清培养基稀释的药物处理，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。

c) （可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（Rosup, 100 mM）到常用工作浓度100 μM，加入细胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育90 min。

d) ROS 探针准备：探针装载前按照1:1000 用无血清培养液稀释H₂DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。

e) ROS 探针装载：吸除处理药物，加入适当体积稀释好的H₂DCFH-DA 工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，对于96 孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。

f) 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1～2 次，以充分去除未进入细胞内的H₂DCFH-DA。

2. 收集细胞后装载探针(适用于贴壁细胞和悬浮细胞)

a) 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。

b) 药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。

c) （可选）阳性对照：先用无血清培养基稀释阳性对照（Rosup, 100 mM）到常用工作浓度100 μM，加入细胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育30-60 min，MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育90min。

d) ROS 探针准备：探针装载前，按照1:1000 用无血清培养液稀释H₂DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。

e) 探针装载：除去细胞内药物，离心收集细胞，加入稀释好的探针，使其细胞密度为1×10⁶ ～ 2×10⁷。

注意：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。例如：对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于10⁴，也不可多于10⁶。

f) 细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2 次，以充分去除未进入细胞内的H₂DCFH-DA。

二. 荧光显微照相操作方法

1. 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。

2. 荧光显微镜下，选用FITC 滤光片观察荧光，去除背景观察荧光的变化。

三. 流式细胞分析操作方法

1. 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5-1 mL PBS 重悬细胞(0.5～1 x 10⁵/ml)。

2. 选择流式细胞仪FL1 或BL1 通道，488nm 激发，测定530nm 的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的绿色荧光。

四.参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。

注意事项：

1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2. 阳性对照Rosup 一般使用浓度为100uM (推荐浓度100-400uM，具体依细胞类型而定)。通常刺激后0.5-4h 可观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30min 内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。

3. 对于某些特别的细胞，实验过程中如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强， 可以按照1:2000-1:5000 稀释H₂DCFH-DA ， 使H₂DCFH-DA 的终浓度为2-5 uM。探针装载的时间也可以根据情况在15-60 min 内适当进行调整。

4. 活性氧阳性对照(Rosup) 仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

5. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考上图。

6. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。

7. 如需定量，需制作标准曲线。通过测定不同浓度的H₂O₂氧化H₂DCFA的荧光值做标准曲线，X轴为H₂O₂浓度，Y轴是荧光值。根据样品的荧光值即Y值，计算X值即对应的H₂O₂浓度

8. 有的细胞装载探针后细胞容易漂起来，洗细胞时实验组会吸走一部分细胞。所以种细胞时细胞量增加一倍，这样细胞紧密连接，贴壁比较牢，实验组的荧光值就高了。另外的H₂DCFDA很敏感，工作液浓度要低一些，1-2uM就够啦，浓度太高容易有非特异性染色。这个探针很不稳定，一旦氧化了本底荧光值就会升高，最好工作液现用现配。

9. 为了您的安全和健康，操作时必须戴口罩/手套/实验服和其它生化实验室防护措施。

10. 本产品仅限于专业人员用于生命科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅。