检测范围:7.81-500pg/mL 灵敏度: 1.61 pg/mL
精密度:板内变异系数<10%,板间变异系数<10%
回收率:范围从 87%到 95%,平均回收率 91%
特异性:检测具有高灵敏度和优良的特异性。未观察到和人基质金属蛋白酶8(MMP8)类似物之间的显着交叉反应或干扰。
适用样本:血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清和其他生物体液
检测原理
该试剂盒采用双抗夹心酶联免疫吸附法原理。酶标板预包被亲和纯化的抗人MMP-8的抗体。将含有人MMP-8 的样品或标准品加入到酶标板中,与包被抗体反应。再加入生物素标记的检测抗体,并与酶标板上捕获的人MMP-8结合。接着,加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)以形成固相抗体-人MMP-8-生物素标记抗体-SA-HRP的夹心复合物。然后,将TMB溶液加入孔中并进行孵育,酶促反应产生蓝色物质,加入终止液后,变成黄色。在450nm 波长下测定吸光值。最后通过建立标准曲线,根据OD值来计算样品中人MMP-8的浓度。
试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在 2-8 ℃保存 6 个月;如果开封使用后,请按照下表中的条件分别保存各组分。
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
预包被微孔板 | 48孔 | 96孔 | -20℃ |
标准品 | 冻干粉, 1支 | 冻干粉, 2支 | -20℃ |
检测试剂 A(生物素化抗体100×) | 60μL | 120μL | -20℃ |
检测试剂 B(SA-HRP酶结合物100×) | 60μL | 120μL | -20℃ |
标准品/样品稀释液 | 10mL | 20mL | 2-8℃ |
检测试剂A稀释液 | 6.5mL | 13mL | 2-8℃ |
检测试剂B稀释液 | 6.5mL | 13mL | 2-8℃ |
洗涤液 (25×) | 15mL | 30mL | 2-8℃ |
底物溶液(TMB) | 5mL | 10mL | 2-8℃避光保存 |
终止液 | 5mL | 10mL | 2-8℃ |
封板膜 | 2张 | 4张 | 室温 |
说明书 | 1份 | 1份 | 室温 |
自备耗材
酶标仪(能测450nm处的吸光度)
多通道移液器或自动洗板机
恒温箱、低温离心机
可调节式移液枪及枪头
去离子水
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
1.使用前将所有试剂平衡至室温(18-25℃)。按照酶标仪说明书进行设置检测波长为450nm,并在读板前预热 15 分钟。
2.洗涤液:取浓缩洗涤液,根据检测数量,用去离子水或蒸馏水1:24稀释,混匀后备用(浓缩洗涤液如有结晶可40℃水浴溶解后再使用)。
3.检测试剂A工作液:实验前计算所需量(100μL/孔)。在准备工作中,应该准备比计算量稍微多一点(多 100-200μL)。使用前15分钟,将原液管离心,用检测试剂 A 稀释液将 100×浓缩检测试剂 A 稀释至 1×工作液(如:10μL 检测试剂 A + 990μL 检测试剂 A 稀释液)。
4.检测试剂B工作液:实验前计算所需量(100μL/孔)。在准备工作中,应该准备比计算量稍微多一点(多 100-200μL)。使用前15分钟,将原液管离心,用检测试剂 B 稀释液将 100×浓缩检测试剂 B 稀释至 1×工作液(如:10μL 检测试剂 B + 990μL 检测试剂 B 稀释液)。
5.标准工作液:首先,标准品1000×g 离心1min,加入1mL标准品/样品稀释液,使其静止10min 再轻柔混匀,这就是500pg/mL工作储备液,然后取7个 EP 管,每管内加入500μL标准品/样品稀释液。吸取 500μL 500pg/mL 标准品稀释液到第一个管内再混匀即为250pg/mL 工作液。按照下表将500μL的溶液从前管移到后管中。在下一次转移前,将每管彻底混匀。设定7个梯度稀释标准品如 500pg/mL,250pg/mL,125pg/mL,62.5pg/mL,31.25pg/mL,15.63pg/mL,7.81pg/mL, 最后1个装有标准品/样品稀释液的 EP 管是空白对照作为 0pg/mL。
标准品体积 | 标准品/样品稀释液体积(µL) | 标准品浓度(pg/mL) | |
Std.1 | 1000µL 500pg/mL | 0 | 500 |
Std.2 | 500µL of Std.1 (500pg/mL) | 500 | 250 |
Std.3 | 500µL of Std.2 (250pg/mL) | 500 | 125 |
Std.4 | 500µL of Std.3 (125pg/mL) | 500 | 62.5 |
Std.5 | 500µL of Std.4 (62.5pg/mL) | 500 | 31.25 |
Std.6 | 500µL of Std.5 (31.25pg/mL) | 500 | 15.63 |
Std.7 | 500µL of Std.6 (15.63pg/mL) | 500 | 7.81 |
Blank | 0 | 500 | 0 |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品,工作储备液可2-8℃保存一周。
样品收集
血清:让血样在室温下凝结 2 小时或在 2-8℃下过夜,然后在 2-8℃下 2000× g 离心 15 分钟。随后立即取上清液进行检测,或存储在-20℃或-80℃备用。
血浆:使用 EDTA 或肝素作为抗凝剂收集血浆。采集后 30 分钟内,在 2-8℃,2000×g 条件下离心样品 15 分钟,随后立即取上清液进行检测,或存储在-20℃或-80℃下备用。
组织匀浆:应在预冷的 PBS 中冲洗组织,彻底清除多余的血液,称重,切成小块。然后在冰上的采用玻璃匀质器在 PBS(组织重量(g):PBS(mL)体积=1:9)中均质化组织块。使用超声波细胞破碎机对所得匀质悬浮液进行超声处理,直到溶液澄清。然后将匀浆在 10000×g 下离心 5 分钟。随后立即取上清液进行检测,或存储在-20℃或-80℃下备用。
细胞裂解物:对于粘附细胞,用适量预冷的 PBS 轻轻清洗细胞,并用胰蛋白酶分离细胞。以 1000×g 离心 5 分钟收集细胞(悬浮细胞可直接离心收集)。弃上清,用冷 PBS 清洗细胞 3 次。以浓度为5×106 个细胞/1mL 预冷 PBS 重新悬浮细胞。重复冻融数次,直到细胞完全溶解。1500×g,2-8℃离心 10min。随后立即取上清液进行检测,或存储在-20℃或-80℃下备用。
细胞培养上清和其他生物体液:在 1500×g,2-8℃条件下离心样品15分钟。随后立即取上清液进行检测,或存储在-20℃或-80℃下备用。
注意:不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在6天内使用,则可以将其储存在2-8℃,长期保存需分装存储在-20℃或-80℃,避免反复冻融。测定前,应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本用标准品/样品稀释液稀释几个不同倍数做预实验确定合适的稀释倍数,计算结果乘以稀释倍数。
实验步骤
1.从板框上取下待用的微孔板条,将剩余的板条放回装有干燥剂的铝箔袋中,然后重新密封保存。
2.将标准工作溶液加入前两列,每个浓度设置一个复孔(每孔100μL)。其余孔加入100μL待测样本(建议通过预实验确定待检样本的稀释倍数)。盖上试剂盒提供的封板膜。37℃孵育90分钟。
3.手工洗板:弃去每孔中的液体,每孔加入350μL洗涤液。浸泡30秒再倒出每孔中液体并在干净的吸水纸上拍干。重复这个洗涤步骤,共3遍。洗板机洗板:选择洗涤3次程序洗板后拍干。
4.向每孔中加入100μL 的检测试剂A工作液。盖上封板膜。37℃孵育60 分钟。
5.弃去每孔中的液体,重复步骤3的洗涤过程3遍。
6.向每孔中加入100μL的检测试剂 B工作液。盖上封板膜。37℃孵育30分钟。
7.弃去每孔中的液体,重复步骤3的洗涤过程5遍。
8.每孔加底物溶液(TMB)100μL。盖上新的封板膜。37℃避光孵育 10-20 分钟(当标品浓度梯度后三孔有明显蓝色梯度,前三孔的梯度不明显时即可终止)。
9.每孔加入 50μL 的终止液,顺序与加入底物溶液(TMB)的顺序一致,轻轻晃动混匀。
10.确保酶标板孔底无气泡水雾等,立即在450nm 测量每孔的吸光度 OD 值。
计算
每个标准品和样品的重复读数分别取平均值,然后减去零孔 OD 的平均值。以x 轴为 OD 值,y 轴为标准品浓度。拟合一条标准曲线,将样本减去零孔后的OD值作为x带入计算y(浓度) 。如果样品被稀释,从标准曲线上读出的浓度必须乘以稀释系数。
结果展示
典型标准曲线(R2≥0.99)
人基质金属蛋白酶8(MMP8)标准曲线。数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。终止液有一定的腐蚀性,操作时请做好防护措施。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。收到试剂盒后,未开封的试剂盒可在2-8℃下保存1个月。如果试剂盒在1个月内不使用,请在收到试剂盒后,将每个组件分别存放在上表中指示的温度下。
4. 新打开的ELISA酶标板可能含有水雾样物质,此为正常现象,不会对实验结果产生任何影响。未用完的板条应立即放回装有干燥剂的铝箔袋中,重新密封并在-20℃下存储。
5. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
6. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。
7. 溶解含有蛋白质溶液时,应始终避免起泡。
8. 不得重复使用稀释后的工作液。
9. 为了得到准确的实验结果,在孵育过程中,必须确保封板膜将酶标板密封。
10. 在使用自动洗板机时,添加清洗缓冲液后,在清洗步骤之间添加30秒的浸泡时间可提高分析精度。
11. 底物溶液保存过程中应为无色,加入到酶标板中之后底物溶液应从无色变为渐变蓝色。
12. 终止液应按照与加底物溶液(TMB)相同的顺序添加到酶标板中。添加终止液后,孔中溶液的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表明终止液未与底物溶液充分混合,应轻拍孔板使其混匀。
疑难解答
问题 | 可能原因 | 解决措施 |
标曲线性不好 | 标准品稀释不正确 | 确保标准品按照推荐方法溶解和稀释 |
移液不准确 | 定期校准移液器并检查枪头密封性 | |
反应液蒸发 | 用封板膜密封酶标板 | |
洗板不彻底 | 足够的洗涤次数和加入足量洗涤液 | |
孔底有异物 | 读数前清洁板底 | |
显色弱或无 | 试剂反应不充分 | 确保孵育时间并按推荐温度孵育 |
试剂体积添加不足 | 检查移液器并严格按照操作步骤操作 | |
稀释不正确 | 检查试剂稀释步骤 | |
酶结合物失活 | 混合酶结合物和底物,通过显色反应检查 | |
OD值低 | 酶标仪设置不正确 | 检查仪器波长 |
没加终止液 | 加入适量终止液 | |
读板时等待时间太长 | 及时读板 | |
背景高 | 显色液被污染 | 更换显色液 |
显色时间太长 | 控制显色时间 | |
反应试剂稀释错误 | 使用推荐稀释方法 | |
洗板不彻底 | 足够的洗涤次数和加入足量洗涤液 |
PMK1303.人铁蛋白(Ferr)ELISA试剂盒
PMK1304.人转铁蛋白(TF)ELISA试剂盒
PMK1305.人β-2微球蛋白(B2M)ELISA试剂盒
PMK1310.人鳞状细胞癌抗原(SCCA)ELISA试剂盒
PMK1311.人降钙素原(PCT)ELISA试剂盒
PMK1314.人脑源性神经营养因子(BDNF)ELISA试剂盒
PMK1315.人基质金属蛋白酶3(MMP3)ELISA试剂盒
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