产品简介：
Super Flour 488, SE 是一种可标记蛋白或其他具有胺基的生物分子的深红⾊荧光染料。功能类似于 Alexa Fluor 488 ,Cy5 及 DyLightTM 649，但因其有着更高的量子范围和极好的水溶性，使得它有更好的蛋白染色效果。此外， ALEXA FLUOR488, SE 有超强的光稳定性，因而更适用于共聚焦和单分子成像检测。Super Flour 488, SE 的这些性质使 其成为最好的蛋白和核酸染料。
使用方法：
1、实验材料
IgG：IgG 不可含有可与染料反应的胺类化学物质，如: 氨基酸,Tris 等。如果 IgG 中含有此类化学物质，必须⽤ pH～7.4 的 PBS 缓冲液预先透析处理。叠氮类化合物的存在 不会影响标记反应。
Super Flour 488, SE ；NaHCO3 ；葡聚糖凝胶 G-25 透析柱；PBS 缓冲液(pH～7.4)；NaN3；BSA
2 、标记方法和步骤
2.1 准备标记抗体用2mL 0.1 M NaHCO3 溶液（pH～8.3）稀释 5mg 抗体。如果产品预先用磷酸盐缓冲液稀释，如 PBS 缓冲液（不含胺基类化合物），那么可以直接在该缓冲液中加入约 1M 的 NaHCO3 母液，调整 NaHCO3 工作浓度至～0.1 M。低于 2.5 mg/mL 浓度的蛋白也可用于标记，不过此浓度下标记效率会降低。当蛋白浓度用于 5 mg/mL 时，标记效率可能更高。由于缓冲液和蛋白纯度存在差异性，因而更精确的标记效率由实际操作条件决定。如果标记蛋白浓度稀释过低，可以通过超滤法进行浓缩。
2.2 准备染料储存液 室温预热一管 1mg Super Flour 488, SE，在管中加入 0.1 mL 的无水 DMSO，配制浓度为 10mM 染料储存液。 适当条件下，可以涡旋以便充分溶解染料。如果使用更微量的蛋白进行标记反应，那么染料需要稀释至更低浓度。
注：（1）剩余的染料储存液应于-20°C 低温存放，以备后续使用。⽤用无DMSO 配制染料储存液，染料至少可以保存一个月。
（2）染料也可以用去水配制，但是由于染料在水中会缓慢水解，所以在结合反应开始前，水配制的储存液最好现配现用。
2.3 标记反应步骤
a) 搅拌或涡旋混匀蛋白溶液，逐步滴加 30-50 μL 的染料储存液（10 mM），使染料/蛋白的摩尔比在 9 : 1 至15 : 1 的范 围内。如步骤 2.1 所述，蛋白稀释浓度越高，染料/蛋白的摩尔比越高，这也意味着标记效率更低。标记 Super Flour 的 IgG 抗体最佳的 DOL(结合于每个蛋白分子上 的染料数量)值在 3-6 范围内。
b) 在室温下搅拌反应 1 小时。
注：在进行结合反应的同时，进行步骤 2.4，平衡葡聚糖凝 胶 G-25 透析柱。
2.4 从反应液中分离标记蛋白
a) 用PBS 缓冲液（pH～7.4）平衡葡聚糖凝胶 G-25 透 析柱（10 mm × 300 mm）。
b) 将步骤 2.3 反应溶液加入柱子，并用 1 × PBS 缓冲液洗脱。首先洗脱出来的着色带是染料-蛋白结合物。 注：（1）对于小规模的标记反应，为了避免过度稀释产物， 可以使⽤超滤装置去除结合物中的自由染料。（2）当结合反应完成后，如不及时分离染料-蛋白结合物，可以加入 50 μL 1M 赖氨酸终止反应。多数情况下，不需要此操作，因为剩余的未反应的染料在反应最后已经被充分水解。
3、确定 DOL（结合于每个蛋白分子上 的染料数量）
3.1 蛋⽩浓度的确定 抗体浓度可通过以下公式计算: C(mg/mL) = {[A280-(Amax × CF)]/1.4} × 稀释因子。
(C 是指实验收集的抗体浓度；稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数（可从下面备注中获得）；A280 和 Amax 分别是指在 280nm 处的吸光度以及在最大吸收波长（~650 nm）处的吸光度；CF 是校正因子，Super Flour 488，SE 的 CF 值为 0.03；1.4 则是指 IgG（mL/mg）的消光系数；)
注：过柱洗脱的蛋白溶液直接用于吸光度检测可能浓度 过⼤，因此需要稀释到大约 0.1mg/mL。稀释倍数（即 稀释因子）需要从起初抗体数量（比如 5mg）以及蛋白液洗脱的总体积来进⾏预估。
3.2 DOL 的估算 DOL 通过下式计算: DOL = (Amax × Mwt × 稀释因子) /(ε × C) 注意：Amax，稀释因子，C 值在 3.1 中已经明确； Mwt是指 IgG 的分子量 (~150,000)； ε 是 Super Flour 488, SE 的摩尔吸 光系数； 标记 Super Flour 488, SE 的 IgG 抗体最佳的 DOL 值在 3-6 范围内，有时会上下略有波动。
