产品简介：
Super Fluor系列（可替代Alexa Fluor 系列）荧光探针，具有更强的荧光强度，更广的pH应用范围（pH 4～10）, 更好的抗淬灭性。在生物荧光领域已逐渐替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等荧光染料。 Super Fluor 750 NHS= Super Fluor 750 SE～Alexa Fluor 750 SE。
原料准备：
A．活性染料 1mg；B．碳酸氢钠 ～84mg；C．抗体纯化树脂P-30／Sephadex G25M／透析袋；D．空柱 5 个；E．收集管 5 个；
注意：纯化的蛋白buffer中不得含有铵离子或伯铵，因为它们会与蛋白质竞争结合活性染料。不纯的抗体或者含BSA或明胶的抗体标记效果不好。低浓度的NaN3(<3mM)或thimerosal（<1mM）不影响偶联效果。
实验步骤：
1. 蛋白溶解：用0.1 M NaHCO3溶解至终浓度为2mg/ml。将1ml 去离子水加入84mg NaHCO3瓶中，配成1M碳酸氢钠溶液。振荡或吹打至完全溶解。该溶液pH～8.3，2～6℃保存可用2星期；若抗体是溶液，将抗体稀释至2mg/ml，再加入1/10 体积的上述碳酸氢钠溶液；若抗体是冻干粉，将1M 碳酸氢钠溶液用10 倍去离子水稀释成0.1M 后，用其将抗体溶成2mg/mL的溶液；
2. 染料溶解：染料固体粉末从冰箱放入干燥器中慢慢升至常温后，用无水DMSO将染料配置浓度为1mg/mL.
3. 标记：在1mL蛋白溶液中缓慢加入适量染料溶液(蛋白：染料摩尔比=1:20～50；质量比可在以下范围内优化 10～200ug Superdye每毫克IgG抗体)。同时在暗处常温缓慢搅拌1小时(也可以直接将蛋白溶液直接加入染料的固体粉末的试剂瓶中，同时在暗处常温缓慢搅拌1小时)。
4. 纯化：选择下面三种方式纯化后，产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM叠氮化钠溶液中，-20℃避光储存。
5. 贮存：标记好的蛋白贮存于2～6℃，避光。若纯化的蛋白偶联物浓度小于1mg/ml，加入BSA 或其他稳定蛋白1～10mg/ml。在2mM NaN3存在的情况下，2～6 度可保存几个月。保存更长时间，则需分装后-20℃保存。避免反复冻融，避光保存。
纯化方法1、透析法：
1) 简单纯化可用100 mL 0.15 M NaCL溶液常温避光透析4次,每次4小时除去未标记上的染料。
2) 在4℃用新鲜的1L0.15 M NaCl溶液再避光透析过夜。
3) 用100 mL of 0.01 M PBS/ 0.01% NaN3溶液常温避光透析4小时，在4℃常温避光再次透析过夜。
4) 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。
纯化方法2.P-30柱子
1) 0.5g p-30凝胶加入9mL PBS(pH=7.4)室温过夜放置；次日，弃上清；真空抽滤5min;
2) 加入9mL PBS,轻柔震荡均匀，放置20min后，去除上清液
3) 再重复2
4) 将树脂柱放入一个13×100mm玻璃管柱中，每个柱子加入1.5mL(不要多加)，填的要均匀不能有气泡。具体方法是：搅动纯化树脂(组分C)，加入1.0mL悬浮液至空柱中静置；全部下沉后再加入0.5m树脂至床体积为～1.5ml盖上盖子，室温保存。
5) 将树脂柱上下端的口打开。放入10mL离心管中，水因重力自然流下，用垂直转子1100g 离心3min, rpm与相对离心力g的换算公式如下：相对离心力g=(1.12×10-5)(rpm)2(半径cm)；离心后静置待缓冲液全部流出，弃去缓冲液，保留收集管（若没有垂直转子，角转子也可)
6) 换上干净的离心管，将标记的蛋白反应液200μl逐滴加入树脂的中心部位，使溶液被吸入胶床中；
7) 将树脂柱放入空的收集管中，1100g 离心5min
8) 8）离心后收集管内是标记好的蛋白，溶在100μL PBS中(PH7.2，含2mM的NaN3)，未结合的染料保留在柱中，弃去树脂柱。注意事项：配置柱子时，用较细的小瓶，每个小瓶配置2个柱子。便于去除水分。填柱子时，加到1.5mL、尽量不要多加，离心时间按照说明书1000g/3min
纯化方法3.PD-10 column
3.1.装填柱层析分离吸附柱
1)提前用去离子水浸泡葡聚糖Sephadex过夜(1g配5mL水)，使其溶胀，打开孔状结构。
2) 湿法装柱：(装填过程中确保PBS(10mM,pH=7.4)液面比Sephadex高，以防混入空气而产生气泡)先在柱子(13×100mm)内注入3/4左右的PBS，而后加入Sephadex /PBS溶液；分批次、缓慢加入柱子内，最后用塑料滴管吸取，沿着柱子四壁旋转，逐步、缓慢地加入，装填至近满，留下约3cm的空间以待注入荧光标记蛋白溶液；
3)在装填的个过程中打开活塞(淋出液用大烧杯承接)，同时用玻璃棒+橡胶塞从下到上轻轻敲打柱子，使Sephadex装填紧密，注意使柱子内不得有气泡，不得有断层，使柱子竖直，确保顶部端面水平；(滴加Sephadex时应旋转加入，不得直接滴加，以免激起柱顶层)
4)装填完柱子后，用塑料滴管吸取PBS，沿管口四壁旋转着缓慢加入，使PBS过一遍柱子，而后将PBS注入Sephadex顶部，以隔绝空气，以免在柱内产生气泡，关闭末端活塞；
3.2过柱层析分离吸附柱(避光)
1) 打开柱子未端活塞，缓慢放出柱子顶层的PBS，待PBS液面刚与Sephadex柱子端面相平时，立即关闭活塞；注意不要使PBS液面低于Sephadex柱子端面，以免混入空气而在柱子内产生气泡；立即用塑料滴管吸取荧光蛋白溶液，沿柱子四壁旋转，缓慢加入(全部加完，不要搅动Sephadex随时保持其端面水平)
2)待荧光蛋白溶液全部加完后，打开活塞，使荧光蛋白溶液流入柱子中；
当荧光蛋白溶液的液面刚刚完全进入柱子时，立即用塑料滴管加入PBS(缓慢沿管子四壁旋转加入)，在荧光蛋白溶液过柱子的过程中注意随时添加PBS，确保Sephadex端面不与空气接触；
3)用烧杯承接最初的淋出液，几分钟后带颜色的溶液便从柱子顶部往下流，而后分作三段；柱子下端(靠近活塞)：荧光标记的蛋白，带颜色，流速较快；
柱子中间：空白无颜色部分，两者的过渡区域；
柱子上端：未与蛋白反应的染料，带颜色，流速较慢；
4)待下端带颜色的荧光蛋白溶液的前沿进入活塞时，立即用5mL冻存管(锡箔纸避光)承接此淋出液(此即荧光蛋白溶液)；直至荧光蛋白溶液的尾部进入活塞口为止。
5）用10倍柱体积的PBS洗掉未反应的染料。使柱子再生后重复使用。长时间储存柱子可用含0.05%NaN3的PBS溶液平衡柱子后，密闭封严在2～8℃储存。
计算标记比例F/P值：
对于IgG 等大多数抗体来说，摩尔吸光系数为203000，F/P值在4～9 之间是最合适。
1. Super Flour 488标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和494nm的光吸收；
2) 计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A494×0.11))×稀释倍数/203000
3)计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A494×稀释倍数/71000×蛋白摩尔浓度)
2. Super Flour 555标记蛋白F/P值计算：
1）用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和555nm的光吸收；
2)计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A555×0.08))×稀释倍数/203000
3）计算标记比例：每摩尔蛋白结合的染料摩尔数 =A555×稀释倍数/(150000×蛋白摩尔浓度)
3. Super Flour 647标记蛋白F/P值计算：
1)用PBS精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和650nm的光吸收
2)计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A650×0.03))×稀释倍数/203000
3) 计算标记比例： 每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A650×稀释倍数/(239000×蛋白摩尔浓度)
4. Super Flour 680标记蛋白F/P值计算
1)用PBS 精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和680nm的光吸收；
2) 计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A650×0.05))×稀释倍数/203000
3)计算标记比例：有摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A650×稀释倍数/(184000×蛋白摩尔浓度)
5Super Flour 750标记蛋白F/P值计算：
1)用PBS精确倍数稀释定量的少许纯化过的偶联蛋白，在1cm比色皿中测定280nm和750nm的光吸收；
2) 计算样品中的蛋白浓度：蛋白摩尔浓度=(A280-(A750×0.04))×稀释倍数/203000
3 计算标记比例：每摩尔蛋白结合的染料摩尔数=A750x稀释信数/(240000×蛋白摩尔浓度)
常见问题：
1.标记效率低 计算结果显示每摩尔145，000 MW的蛋白标记的荧光团少于4摩尔，可能有以下原因：
1)抗体缓冲液中含有痕量伯胺成分，与染料反应降低了标记效率。如果蛋白已经溶于含氨基的缓冲液(如Tris或氨基乙酸)标记前用PBS透析。
2)蛋白含量较低( ≤1mg/mL)会影响标记效率。
3) 标记步骤中加入碳酸氢钠的作用是将反应混合物的pH升高至～8，因为在弱碱性环境中标记反应的效率最高。如果蛋白溶液的缓冲范围在低pH，建议用0.1M的NaHCO3透析。
4) 研究显示pH升至9.0～9.4，标记效率和标记速度(只需10min)明显改善。
5)不同抗体与荧光团的反应速率不同，染料标记后保留的生物活性程度也不同，客户需根据自己的条件优化标记步骤。为增加标记率，可以对同一样品进行再标记，或减少蛋白的量加大染料的量重新标记。有研究者在室温孵育1小时后再4℃孵育过夜，情况有所改善。
2. 过标记--计算结果显示每摩尔145，000 MW 的蛋白标记的荧光团大于10摩尔。虽然过标记的蛋白也可以使用,但可能会引起蛋白的聚集、降低抗体结合抗原的特异性，这些都会造成非特异性结合。过标记还会引起荧光淬灭。可以增加蛋白或减少反应时间。
3.未结合染料未去除 —如果游离染料残留在偶联物溶液中，使标记计算的值偏高。可用分离柱再次分离或透析去除。
4.蛋白或蛋白偶联物无法洗脱 不要再加缓冲液，只需再次离心一次或几次。
注意事项：
1) 其水溶液现配现用不能储存；
2) 任何溶解后的染料最好立即使用；
3) 无水的DMSO溶液-20°C保存最多2个星期。
