活体成像实验相关试剂

水溶性Cy5.5

货号:PMK0910
规格:5mg
价格:3400元
库存:8
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介:

Cy5.5 是一种 CY 染料。CY 为花菁 (Cyanine) 的缩写,是由奇数个甲基单位连接的两个氮原子组成的化合物。菁类化合物具有波长长、吸收和发射可调、消光系数高、水溶性好、合成相对简单等特点。CY 系类染料常被用于蛋白,抗体以及小分子化合物的标记,对于蛋白抗体的标记,可以通过简单的混合反应来完成结合,以下我们介绍了蛋白抗体标记的标记方法,具有一定的参考意义。

操作步骤:

原液制备
1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效果,请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。
1) 蛋白溶液 pH 值应为 8.5±0.5,若 pH 低于 8.0,则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL,标记效率会大大降低,为了获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中,否则会影响标记效率。
2. 染料准备
将无水 DMSO 稀释 CY 染料,制成 10 mM 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。
注:CY 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
3. 染料工作液用量计算
标记反应所需的 CY 染料用量取决于要标记蛋白的用量,CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
例:假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000),用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY 染料,则所需 CY 体积为 3.95 μL,详细计算流程如下(以CY3-NHS ester为例)  :
1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) ×mL (IgG) / MW (IgG) =2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol
2) mmol (CY3-NHS ester) = mmol (IgG) ×10 =6.7×10-6 mmol×10 = 6.7×10-5 mmol
3) μL (CY3-NHS ester) = mmol (CY3-NHS ester) ×MW (CY3-NHS ester) / mg/μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol / 0.01 mg/μL =3.95 μL (CY3-NHS ester)

使用方法
1. 标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL CY 染料缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品溶液中,轻轻摇匀混合,然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀,防止蛋白样品变性失活。
2) 将该反应小管置于避光处,在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟,每隔 10–15 分钟,将反应小管轻轻颠倒几次,以充分混合两种反应物,提高标记效率。
2. 蛋白纯化脱盐

以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
1) 制备 SepHadex G-25 柱。
2) 将反应混合物装入 SepHadex G-25 色谱柱顶部。
3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时,立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4),完成柱纯化。结合含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。


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