产品简介
谷胱甘肽还原酶（GR）是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，GR催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被硫氧还蛋白还原酶（TrxR）取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值平衡。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外，GR还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、细胞以及细菌样本中GR的活性水平。其原理是，GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 60mL | 120mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及水浴锅
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂三：粉剂；使用前96T每管加入2mL去离子水，48T加入1mL去离子水，混匀，现配现用，置于冰上；分装-20℃避光保存。
样本制备
动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL预冷的试剂一，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的试剂一，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）：直接测定。
注意：
1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月，样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。
2. 细胞中GR活性测定时，细胞数目须在3~5×106之间，细胞中GR的提取时可加试剂一后匀浆或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
3. 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒，进行样本蛋白质浓度测定。由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约0.1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去试剂一本身的蛋白含量。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2. 试剂一置于25℃（普通物种）或者 37℃（哺乳动物）中预热30min以上。
3. 样本测定：在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10μL试剂二，20μL试剂三，20μL样本，150μL试剂一，混匀，于340nm 测定10s和190s吸光度，记为 A1和A2，计算△A=A1-A2
注意：
1. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。确保180s内吸光值变化呈线性（可每分钟测定1次观察变化趋势），当出现初始180s内吸光值不稳定时，可以适当延长反应时间，选取相对稳定的时间段内吸光值变化值。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量；如果吸光值变化较为剧烈且不呈线性，样本可用试剂一进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释2~5倍。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度，pH 8.0条件下，每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化。
GR酶活(U/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=1072×△A÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：在一定温度，pH 8.0 条件下每克样品在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化。
GR酶活(U/g 鲜重)= [△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1072×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：在一定温度，pH 8.0 条件下，每104个细胞在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化。
GR酶活(U/104 Cells)=[△A÷(ε×d) ×V反总×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.144×△A
（4）按液体体积计算
活性单位定义：在一定温度中，pH 8.0 条件下，每毫升液体样本在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH氧化。
GR 酶活(U/mL)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷V样÷T=1072×△A
ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=2×10-2 mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；500：细胞数量，5×106。
B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
