产品简介
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水化合物，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具有毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。GST催化反应会减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、细胞、细菌样本中GST的活性。GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃ |
显色物 | 10mL | 20mL | 4℃避光保存 |
底物 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
显色物：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
底物：使用前加入2mL离子水溶解；4℃避光保存。
样本制备
动植物组织：称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的提取液，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集 5×106细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）：直接测定。
注意：
1. 样品处理等过程均需要在冰上进行，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月。
2. 细胞中GST活性测定时，细胞数目须在3-5×106之间，细胞中GST的提取时可加提取液后匀浆或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
3. 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长到340nm，可见紫外分光光度计去离子水调零。
2. 显色物和底物置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）孵育15min。
3. 样本测定：在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入20μL样本，180μL 显色物和20μL底物，
迅速混匀后于340nm 测定吸光度变化，记录10s和 310s 吸光度为A1和A2。计算△A=A2-A1，
注意：
1. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。若5min 内反应不成线性（可每分钟测定1次观察变化趋势），建议对样品用去离子水稀释，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
A. 使用96孔UV板测定的计算公式
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或37℃中，每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol CDNB与GSH结合。
GST（U/mg prot）=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=460×△A÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样品在反应体系中每分钟催化1nmol CDNB与GSH结合。
GST（U/g 鲜重）=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=460×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞在反应体系中每分钟催化1nmol CDNB与GSH结合。
GST（U/104 Cells）=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=460×△A÷500=0.92×△A
（4）按液体体积计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫升液体样本在反应体系中每分钟催化1nmol CDNB与GSH结合。
GST（U/mL）=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷V样÷T=460×△A
ε：产物摩尔消光系数，9.6×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；109：1mol=1×109nmol；V反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；500：细胞数量，5×106。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d：0.5cm调整为d：1cm进行计算即可。
