产品简介
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GPX不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与活性氧（ROS）反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。GPX的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GPX的必需部分，测定GPX的活力可以作为衡量机体硒水平的一项生化指标。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、细胞、细菌样本中GPX的活性。GPX催化H2O2氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm光吸收减少速率来计算 GPX 活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 60mL | 120mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1 | 2 | -20℃避光保存 |
试剂三 | 1 | 2 | 4℃避光保存 |
试剂四 | 100μL | 200μL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液配制：临用前，取试剂二一瓶，加入试剂一10mL，充分溶解后，取少量混合液于一瓶试剂三中，充分混匀后再转移回试剂二中，混匀待用。（当天用完）
试剂四：使用前吸取试剂四21.5μL 加入5mL去离子水，充分混匀，临用前配制，配制好的试剂当天使用；4℃避光保存。
样本制备
动植物组织：称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的试剂一，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1mL 预冷的试剂一，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）：直接测定（如需要可用生理盐水稀释不同倍数）。
注意：
1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月，样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。
2. 细胞中GPX活性测定时，细胞数目须在3~5×106之间，细胞中GPX的提取时可加试剂一后匀浆或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
3. 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒，进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2. 工作液和稀释后的试剂四置于25℃（普通物种）或者 37℃（哺乳动物）中预热30min以上。
3. 样本测定：在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入20μL样本，160μL工作液，20μL稀释后的试剂四，迅速混匀，于340nm处测定30s和210s吸光度，记为 A1和A2，计算△A=A1-A2
注意：
1. 实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果△A小于0.001可适当加大样本量。如果△A大于0.5，样本可用试剂一进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
A. 使用96孔UV微孔板测定的计算公式如下：
（1）按蛋白浓度计算
GPX 活力单位定义：一定温度中，每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH 氧化为1个酶活单位。
GPX(U/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=1072×△A÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
GPX 活力单位定义：一定温度中，每克样品在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH 氧化为1个酶活单位。
GPX（U/g 鲜重）=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1072×△A÷W
（3）按细胞数量计算
GPX 活力单位定义：一定温度中，每 104个细胞在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH 氧化为1个酶活单位。
GPX(U/104 Cells)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1072×△A÷500=2.144×△A
（4）按液体体积计算
活性单位定义：一定温度中，每毫升液体样本在反应体系中每分钟催化1nmol NADPH 氧化为1个酶活单位。
GPX(U/mL)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷V样÷T=1072×△A
ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；109：1 mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白浓度mg/mL；W：样品质量，0.1g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL =0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；500：细胞数量，500万。
B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
