产品简介

硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）属于过氧化物酶家族，在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用，功能与谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）类似，也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内，如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌，在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、细胞及细菌样本中TPX的活性。TPX催化H₂O₂氧化二硫苏糖醇（DTT），通过测定240 nm（H₂O₂的吸收波长）吸光度的下降速率，用总活性减去过氧化氢酶（CAT）催化分解的H₂O₂，即可计算出TPX活性。本试剂盒可以同时测定样品TPX和CAT活性。  

产品内容

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计（能测240 nm处的吸光度）及水浴锅

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

低温离心机、制冰机

去离子水

匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

试剂一：即用型；室温保存。

试剂二：即用型；使用前，平衡至室温；-20℃避光保存。

试剂三：即用型；使用前，平衡至室温；4℃避光保存。

样本制备

动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL 试剂一，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

细胞、细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 试剂一，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200 W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

血清等液体的准备：直接测定。

注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月，样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。

2， 细胞中TPX活性测定时，细胞数目须在3-5×10⁶之间，细胞中TPX的提取时可加试剂一后匀浆或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。

3. 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒，进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1．酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm，紫外分光光度计去离子水调零。

2．试剂一和试剂二置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热30min。

3．样本测定：在96孔UV板或微量石英比色皿中加样，每孔先加入4μL样本上清液，再加入180μL 试剂一（CAT活性测定）或 180μL 试剂二（总活性测定），最后加入16μL试剂三，充分混匀。测定240nm处的吸光值，分别记录10s和130s吸光值，测CAT活性记为A₁和A₂，测总活性测定记为A₃和A₄。

注意：1. 实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。

3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。

结果计算

A. 使用96孔UV微孔板测定的计算公式如下

(1) 按蛋白浓度计算

活性单位(U)定义：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol H₂O₂降解为1个酶活单位。

CAT活性(U/mg prot)=(A₁-A₂)÷(ε×d)×V_反总÷(Cpr×V_样) ÷T=1147×(A₁-A₂)÷Cpr

总活性(U/mg prot)=(A₃-A₄)÷(ε×d)×V_反总÷(Cpr×V_样)÷T=1147×(A₃-A₄)÷Cpr

TPX 活性(U/mg prot)=总活性-CAT活性

（2）按样本鲜重计算

活性单位(U)定义： 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化1nmol H₂O₂降解为1个酶活单位。

CAT活性(U/g 鲜重)=(A₁-A₂)÷(ε×d)×V_反总÷(V_样÷V_样总×W)÷T=1147×(A₁-A₂)÷W

总活性(U/g 鲜重)= (A₃-A₄)÷(ε×d)×V_反总÷(V_样÷V_样总×W)÷T=1147×(A₃-A₄)÷W

TPX 活性(U/g 鲜重)=总活性-CAT活性

（3）细胞数量计算

活性单位(U)定义：25℃或者 37℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmol H₂O₂降解为1个酶活单位。

CAT活性(U/10⁴ cells)= (A₁-A₂)÷(ε×d)×V_反总÷(500×V_样÷V_样总)÷T=1147×(A₁-A₂)÷500=2.294×(A₁-A₂)

总活性(U/10⁴ cells)=(A₃-A₄)÷(ε×d)×V_反总÷(500×V_样÷V_样总)÷T=1147×(A₃-A₄)÷500=2.294×(A₃-A₄)

TPX 活性(U/10⁴ cell）=总活性-CAT活性

（4）按液体体积计算

活性单位(U)定义：25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化催化1nmol H₂O₂降解为1个酶活单位。

CAT活性（U/mL）=(A₁-A₂)÷(ε×d)×V_反总÷V_样÷T=1147×(A₁-A₂)

总活性（U/mL）=(A₃-A₄)÷(ε×d)×V_反总÷V_样÷T=1147×(A₃-A₄)

TPX活性（U/mL）=总活性-CAT活性

ε： H₂O₂摩尔消光系数，43600 L/mol/cm=0.0436 mL/nmol/cm； d：96孔板光径，0.5cm；V_反总：反应体系总体积，200μL=0.2mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL； W：样品质量，0.1g；V_样：加入反应体系中上清液体积，4μL = 4×10^-3 mL； V_样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，2min； 500：细胞数量， 5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。