产品简介
硫氧还蛋白还原酶（TrxR）是一种NADPH依赖的二聚体硒酶，包含FAD结构域，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。 TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、细胞及细菌样本中TrxR的活性。TrxR催化催化NADPH还原GSSG生成GSH和NADP+，DTNB与GSH反应生成黄色产物TNB，TNB在412 nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 60mL | 120mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测412 nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂三：粉剂；使用前，96T加入2mL去离子水溶解，48T加1mL去离子水溶解；溶解后的试剂三分装-20℃避光保存。
样本制备
动植物组织：称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的试剂一，冰上匀浆。匀浆后的样本，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 预冷的试剂一，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后10,000 g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）等液体样本：直接测定。
注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月，样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。
2. 细胞中TrxR活性测定时，细胞数目须在3~5×106之间，细胞中TrxR的提取时可加试剂一后匀浆或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
3. 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒，进行样本蛋白质浓度测定。由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约0.1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去试剂一本身的蛋白含量。
实验步骤
1．酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长至412 nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2．试剂一置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热30 min。
3．样本测定：在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入20μL 试剂二，20μL 试剂三，140μL试剂一，20μL样本，迅速混匀后于412nm 测定10s和310s吸光度，记为 A1和A2，计算△A=A2-A1
注意：1. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。使得吸光值在5min内呈线性变化（可每分钟测定1次观察变化趋势），当出现初始阶段吸光值不稳定时，可以适当延长反应时间，选取相对稳定的时间段内吸光值变化值。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量；如果吸光值变化较为剧烈且不呈线性，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，哺乳动物组织及血液制品TrxR活力测定时，一般须用去离子水稀释5倍左右。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB 还原为1个酶活单位。
TrxR (U/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T=294×△A÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1nmol DTNB 还原为1个酶活单位。
TrxR (U/g 鲜重)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=294×△A÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每 104个细胞每分钟催化 1nmol DTNB 还原为1个酶活单位。TrxR (U/104 Cells)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=294×△A÷500=0.588×△A
（4）按液体体积计算
活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol DTNB 还原为1个酶活单位。TrxR (U/mL)=[△A÷(ε×d)×V反总×109]÷V样÷T=294×△A
ε：TNB在412nm处的微摩尔消光系数，13.6×103 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109 nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，0.1g；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，5min； 500：细胞数量，5×106。
B. 使用微量比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
