产品简介
谷胱甘肽有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形态，氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG会被谷胱甘肽还原酶还原成GSH，因此机体中大多数是以还原型形式存在。测定细胞内 GSH 和 GSSG含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态，也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测各种生物样本中GSSG的含量。还原型谷胱甘肽能和 5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸) (5, 5'-dithiobis- 2-nitrobenoicacid, DTNB)反应生成 2-硝基-5-巯基苯甲酸，在波长412nm 处具有最大光吸收，通过2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）将GSSG还原为GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃ |
反应缓冲液 | 10mL | 20mL | 4℃ |
试剂一 | 300μL | 600μL | -20℃避光保存 |
试剂二 | 10 μL | 20 μL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃避光保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测412nm处的吸光度）及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机、去离子水、匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，避光平衡到室温；-20℃避光保存。
试剂二稀释液：使用时，按取试剂二 6µL加水0.12mL的比例配制，整个实验过程中，冰上避光放置。现用现配，用多少配多少；4℃避光保存。
试剂三：使用前96T加 2.5mL水，48T加1.25mL水溶解；分装-20℃避光保存。
试剂四：使用前96T加 2.5mL水，48T加1.25mL水溶解；4℃避光保存。
标准品制备:
稀释提取液：按1:10的比例用去离子水稀释提取液，如：取250 µL 提取液加入2,250 µL去离子水。
20mM GSSG标准品：取1管标准品，用1mL 稀释后的提取液溶解得20mM GSSG标准品；4℃避光保存。
20µM GSSG标准品：取1μL 20mM GSSG标准品用 999μL稀释后的提取液稀释，使用20µM GSSG标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品：
标准品体积 (µL) | 稀释后的提取液体积 (µL) | 标准品浓度(µM) | |
Std.1 | 200 | 0 | 20 |
Std.2 | 100µL of Std.1 | 100 | 10 |
Std.3 | 100µL of Std.2 | 100 | 5 |
Std.4 | 100µL of Std.3 | 100 | 2.5 |
Std.5 | 100µL of Std.4 | 100 | 1.25 |
Std.6 | 100µL of Std.5 | 100 | 0.625 |
Std.7 | 100µL of Std.6 | 100 | 0.313 |
注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备
动物组织：称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的提取液，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000 g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
植物组织：称取0.1g植物组织剪碎，加入1mL预冷的提取液，快速冰上匀浆。匀浆后的样本冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清或血浆：按常规方法收集血清，加入等体积的提取液，4℃，8,000g离心10min，取上清液，置冰上待测。将收集的抗凝血于4℃，600g离心10min，30min内吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的提取液，4℃，8,000g离心10min，取上清液，置冰上待测。
血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10min，弃去上层血浆，用PBS重悬，收集5×106个血细胞，用冷PBS清洗2次（用PBS重悬血细胞，4℃ 600g离心10min），加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集5×106个细胞或细菌，首先用冷PBS清洗细胞2次（用PBS重悬细胞，4℃ 600g 离心10min），加入1mL预冷的提取液重悬细胞或细菌，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。提取过程中去掉蛋白质，所以提取液不能用于测定蛋白含量。
实验步骤
1．酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长至412nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2．试剂二稀释液、试剂三和试剂四37℃保温10min。
3．在EP管中按照如下方式加样：
试剂（µL） | 空白 | 标准 | 测定 |
去离子水 | 0 | 0 | 90 |
稀释后的提取液 | 100 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 100 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 10 |
试剂一 | 5 | 5 | 5 |
混匀，37℃孵育30min，取21µL混合液于微量玻璃比色皿或96孔板中 | |||
混合液 | 21 | 21 | 21 |
反应缓冲液 | 140 | 140 | 140 |
试剂二稀释液 | 2 | 2 | 2 |
试剂三 | 20 | 20 | 20 |
试剂四 | 20 | 20 | 20 |
4．充分混匀，37℃避光孵育10min,记录10min时的吸光度A空、A标、A测。计算ΔA测=A测-A空，ΔA标=A标-A空（空白管只需做1管）。
注意：1. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以最终稀释倍数。
2. 如果样本量过多，可将反应缓冲液、试剂二稀释液与试剂三按照比例混匀配成工作液加入。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准品浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2. 含量计算
将ΔA测带入方程得到y值（1µM=1nmol/mL）。
（1）按样本鲜重计算
GSSG（nmol/g 鲜重）=y×V样÷(W×V样÷V样总)×10×n=10y÷W×n
（2）按液体样本体积计算
GSSG（nmol/mL）=2×y×V样÷V样×10×n=20y×n
（3）按细胞数目计算
GSSG（nmol/104 cells）=y×V样÷(500×V样÷V样总)×10×n=0.02y×n
V样：反应中加入样本体积，0.002mL,根据比例折算10µL×(21÷105)=2µL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；10：样本检测时的稀释倍数,(10+90)÷10；2：液体样本制备时的稀释倍数，加入等体积的提取液即稀释2倍；n：样本进一步稀释的稀释倍数；500：细胞数量，500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
