产品简介
丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）主要存在于酵母和植物体以及少数细菌如：运动发酵单胞菌中，也存在于某些鱼类（包括金鱼和鲤鱼）中。PDC是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。本试剂盒可检测各种样本中 PDC 的活性，其原理是 PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH 还原乙醛生成乙醇和 NAD+，NADH 在340nm有特征吸收峰，而NAD+没有，通过测定340nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | ||
48T | 96T | |||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 | |
试剂一 | 9mL | 18mL | -20℃避光保存 | |
试剂二 | 1.25mL | 2.5mL | 4℃保存 | |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃避光保存 | |
试剂四 | 30μL | 60μL | -20℃避光保存 | |
试剂五 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 | |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测 340nm 处的吸光度）
96 孔 UV 板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、水浴锅
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温，使用前请摇匀；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
混合试剂：临用前配制，将试剂三和试剂四用适量试剂二溶解后，再全部转移到试剂二中备用。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
试剂五：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
样本制备
组织：称取约 0.1g 样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心 10min，取上清液，置冰上待测。
酵母、细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5min（功率 20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后 10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）等液体样本：直接检测。
注意：推荐使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 试剂一25℃水浴提前预热30min。
3. 在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入140μL试剂一，20μL混合试剂，20μL试剂五和20μL样本迅速混匀，测定340nm处吸光值。记录第10s和70s时吸光值，分别记录为A1和A2。△A测=A1-A2。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.002可适当加大样本量。如果ΔA测大于0.4，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式
1. 血清（浆）PDC 活力的计算
单位的定义：25℃中，每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。
PDC (U/mL)=[ΔA测×V反总÷(ε×d)×109]÷V样本÷T=3215×ΔA测
2. 组织中 PDC 活力的计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：25℃中，每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。
PDC (U/mg prot)=[ΔA测×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=3215×ΔA测÷Cpr
(2) 按样本质量计算
单位的定义：25℃中，每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。
PDC (U/g 质量)=[ΔA测×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本)÷T=3215×ΔA测÷W
3. 细菌或细胞中 PDC 活力的计算
按细菌或细胞数量计算
单位的定义：25℃中，每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。
PDC (U/104)=[ΔA测×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本÷V提取×500)÷T=6.4×ΔA测
V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L，V提取：提取液体积，1mL；V样本：反应体系中上清液体积，0.02mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板直径，0.5cm；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1min；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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