产品简介
AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。本试剂盒可检测生物体内AAT活性，其原理是：AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，同时还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412nm吸光度增加速率，来计算AAT活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃保存 |
试剂三 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测412nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、制冰机、低温离心机
无水乙醇
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前96T加入18mL 试剂一，48T加入9mL 试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：临用前96T加入无水乙醇1mL ，48T加入无水乙醇0.5mL，充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存。
工作液的配制：每孔配制190µL工作液：吸取180µL溶解后的试剂二，10µL试剂三。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。
样本制备
动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液捣碎，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。
对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到412nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 恒温箱预热到37℃，工作液置于恒温箱中预热 15min。
3. 在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10μL样本或提取液，190μL工作液，迅速混匀，37℃孵育2min，测定412nm处吸光值。样本的吸光值为A测，提取液的吸光值为A空，计算ΔA测=A测-A空。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于1.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每mg蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AAT 酶活(U/mg prot)= (△A测÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr×V样)÷T×n=1470.6×△A测÷Cpr×n
2. 按照样本质量计算
活性单位定义：每g组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AAT 酶活(U/g 鲜重)=( △A测÷ε÷d×V反总×109)÷(W×V样÷V样总)÷T×n=1470.6×△A测÷W×n
3. 按细胞数量计算
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AAT酶活(U/104 cells)=( △A测÷ε÷d×V反总×109)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T×n =1470.6×△A测÷500×n =2.9412×ΔA测×n
4. 按液体体积计算
活性单位定义：每mL样本每分钟催化产生1nmol TNB 的酶量为1个酶活单位。
AAT 酶活(U /mL)=(△A测÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T×n =1470.6×△A测×n
ε：TNB 摩尔消光系数，13.6×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，L，200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V样：加入上清液体积，0.01mL；T：反应时间，2 min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；V样总：提取液体积，1mL；500：细胞总数，500万。
B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5 cm调整为d:1 cm进行计算即可。
