产品简介
低密度脂蛋白为血清蛋白之一,主要由肝脏合成,是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒。低密度脂蛋白能够进入动脉壁细胞并带入胆固醇,还可被氧化成氧化低密度脂蛋白。当低密度脂蛋白,尤其是氧化修饰的低密度脂蛋白(OX-LDL)过量时,它携带的胆固醇便积存在动脉壁上,久了容易引起动脉硬化。因此低密度脂蛋白被称为"坏的胆固醇"。低密度脂蛋白与冠心病的发生和动脉粥样硬化损伤呈正相关,是脂类疾病分类和风险预测的一个重要指标。本试剂盒可检测生物体内LDL-C含量。其原理是:用沉淀剂分离血清中的低密度脂蛋白胆固醇,利用胆固醇酯酶催化胆固醇酯水解生成游离胆固醇(FC)和游离脂肪酸(FFA),从而把胆固醇酯转化为FC;进一步利用胆固醇氧化酶催化FC氧化,生成△4-胆甾烯酮和 H2O2;再利用过氧化物酶催化 H2O2氧化 4-氨基安替比林和酚,生成红色醌类化合物;在 500nm 有特征吸收峰。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | ||
48T | 96T | |||
提取液 | 10mL | 20mL | 4℃保存 | |
试剂一 | 7.5mL | 15mL | 4℃避光保存 | |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃避光保存 | |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃保存 | |
标准品 | 0.25mL | 0.5mL | -20℃避光保存 | |
标准品稀释液 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计(能测500nm处的吸光度)
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
试剂准备
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
标准品稀释液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:临用前96T加入5mL 试剂三,48T加入2.5mL 试剂三充分混匀待用。用不完的试剂可4℃保存一周或分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
标准品:含 5mmol/L 胆固醇标准品;-20℃避光保存。
工作液的配制:每孔配制200µL工作液:吸取50µL溶解后的试剂二,150µL试剂一。工作液需现配现用,根据需要测定的样本数按比例配制。
标准曲线设置:按下表所示,用标准品稀释液将5mmol/L 胆固醇标准品稀释为5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0 mmol/L 的标准溶液。
标准品体积 | 标准品稀释液体积(µL) | 标准品浓度(mmol/L) | |
Std.1 | 100µL 5mmol/L | 0 | 5 |
Std.2 | 50µL of Std.1 (5mmol/L) | 50 | 2.5 |
Std.3 | 50µL of Std.2 (2.5mmol/L) | 50 | 1.25 |
Std.4 | 50µL of Std.3 (1.25mmol/L) | 50 | 0.625 |
Std.5 | 50µL of Std.4 (0.625mmol/L) | 50 | 0.313 |
Std.6 | 50µL of Std.5 (0.313mmol/L) | 50 | 0.156 |
Std.7 | 50µL of Std.6 (0.156mmol/L) | 50 | 0.078 |
Std.8 | 0 | 100 | 0 |
注意:每次实验都需要新配制标准品。
样本制备
取血后3小时内分离血清,让样品在室温下凝结30 min,然后1,000 g离心15 min,取上层血清立即测定或分装-80℃保存,避免反复冻融。将血清样品与Extraction Buffer按照 2:1 的比例充分混匀,25℃静置 15 min,2,000 g离心15 min,取上清置于冰上待测。
注意:推荐使用新鲜血清样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到500nm,可见分光光度计去离子水调零;恒温箱预热到37℃。
2.样本测定(在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂):
标准(μL) | 测定(μL) | |
不同浓度标准品 | 20 | 0 |
样本 | 0 | 20 |
工作液 | 200 | 200 |
3.混匀,37℃静置 30min,测定 500nm 处吸光值 A。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
所有孔吸光值 A减去零浓度(Std.8)的吸光值得ΔA。
以标准液浓度为y轴,ΔA标准为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将ΔA测定带入方程得到y值(mmol/L)。
2. 低密度脂蛋白(LDL-C)含量计算
LDL-C含量(mmol/L)= 1.5×y
其中,1.5:样本制备过程中的稀释倍数=(2+1)/2=1.5
结果展示
典型标准曲线-数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线