产品简介
甘油三酯(Triglyceride, TG)是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子,不仅是细胞膜的主要成分,也是重要呼吸底物。血清TG是一项重要的临床血脂常规测定指标。本试剂盒可检测血清(浆)、动植物组织、细胞、细胞上清、细菌等样本中甘油三酯(TG)含量,其原理是用异丙醇抽提样本中TG,KOH皂化TG后水解生成甘油及脂肪酸,过碘酸氧化甘油生成甲醛,在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色物质,在420nm有特征吸收峰,其颜色的深浅与TG含量成正比。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 60mL | 120mL | 4℃保存 |
试剂一 | 2mL | 4mL | 4℃保存 |
试剂二 | 3mL | 6mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 3mL | 6mL | 4℃避光保存 |
试剂五 | 3mL | 6mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 0.1mL | 0.1mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测420nm处的吸光度)及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂四:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂五:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
标准品:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
样本制备
动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液冰浴匀浆后,将匀浆液冰浴超声波破碎5min(功率20%或200 W,超声3s,间隔7s,重复30次),8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000 g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
血清(浆)、细胞上清等液体样本:直接测定。
注意:建议使用新鲜样本。如果不立即使用,可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长到420nm,可见光分光光度计去离子水调零。
2. 水浴锅预热到65℃。
3. 甘油三酯的提取(下述操作在EP管中操作):
空白管(μL) | 标准管(μL) | 测定管(μL) | |
去离子水 | 40 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 40 | 0 |
样本上清 | 0 | 0 | 40 |
提取液 | 125 | 125 | 125 |
试剂一 | 25 | 25 | 25 |
将已处理好的样本上清、标准品、空白对照(去离子水)按照上表分别放于提前标注好的EP管中,加提取液后充分混匀,再加试剂一,剧烈振荡30s,静置5min后再剧烈震荡30s,如此反复3次,常温静置一定时间(约5min),待分层后,取上层溶液15μL,置于新的EP管中。
注意:加试剂一后需剧烈震荡,使样本中甘油三酯得到充分提取。
4. 甘油三酯含量的测定:
空白管(μL) | 标准管(μL) | 测定管(μL) | |
上层溶液 | 15 | 15 | 15 |
试剂二 | 50 | 50 | 50 |
试剂三 | 15 | 15 | 15 |
充分混匀,65℃水浴3min | |||
试剂四 | 50 | 50 | 50 |
试剂五 | 50 | 50 | 50 |
充分混匀,65℃水浴15min |
水浴后,取出EP管,冷却至室温后,吸取100 μL至96孔板或微量玻璃比色皿测定420nm处吸光度,空白管记为A空,标准管记为A标、测定管记为A测。计算ΔA测=A测-A空,ΔA标=A标-A空。
注意:空白管和标准管只需测定1次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果A测大于1.0,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
结果计算
1.液体样本中甘油三酯含量:
TG含量(mg/mL)=C标准品×ΔA测÷ΔA标=10×ΔA测÷ΔA标
2.动(植)物组织中甘油三酯含量:
(1)按样本蛋白浓度计算:
TG含量(mg/mg prot)= C标准品×V样×ΔA测÷ΔA标÷(Cpr×V样)=10×ΔA测÷ΔA标÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
TG含量(mg/g 鲜重)=C标准品×V样×ΔA测÷ΔA标÷(V样÷V样总×W)=10×ΔA测÷ΔA标÷W
3.细胞、细菌中甘油三酯含量:
TG含量(mg/104 Cells)=C标准品×V样×ΔA测÷ΔA标÷(V样÷V样总×500)=0.02×ΔA测÷ΔA标
C标准品:10mg/mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;V样:加入样本体积,0.04mL;V样总:样品制备加入提取液的体积,1mL;500:细胞或细菌总数,500万。