产品简介
高密度脂蛋白为血清蛋白之一，主要由肝脏合成，运载周围组织中的胆固醇，再转化为胆汁酸或直接通过胆汁从肠道排出，是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子，俗称“血管清道夫”，对冠心病的临床诊断是一个重要的参考指标。本试剂盒可检测生物体内HDL-C含量。其原理是：用沉淀剂分离血清中的高密度脂蛋白胆固醇，利用胆固醇酯酶催化胆固醇酯水解生成游离胆固醇（FC）和游离脂肪酸（FFA），从而把胆固醇酯转化为FC；进一步利用胆固醇氧化酶催化FC氧化，生成△4-胆甾烯酮和 H2O2；再利用过氧化物酶催化 H2O2氧化 4-氨基安替比林和酚，生成红色醌类化合物；在500 nm有特征吸收峰。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | ||
48T | 96T | |||
提取液 | 10mL | 20mL | 4℃保存 | |
试剂一 | 7.5mL | 15mL | 4℃避光保存 | |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃避光保存 | |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃保存 | |
标准品 | 0.25mL | 0.5mL | -20℃避光保存 | |
标准品稀释液 | 5mL | 10mL | 4℃保存 | |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测500nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
标准品稀释液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前96T加入5mL 试剂三，48T加入2.5mL 试剂三充分混匀待用。用不完的试剂可4℃保存一周或分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
标准品：含 5mmol/L 胆固醇标准品；-20℃避光保存。
工作液的配制：每孔配制200µL工作液：吸取50µL溶解后的试剂二，150µL 试剂一。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。
标准曲线设置：按下表所示，用标准品稀释液将5mmol/L 胆固醇标准品稀释为5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0 mmol/L 的标准溶液。
标准品体积 | 标准品稀释液体积（µL） | 标准品浓度（mmol/L） | |
Std.1 | 100µL 5mmol/L | 0 | 5 |
Std.2 | 50µL of Std.1 (5mmol/L) | 50 | 2.5 |
Std.3 | 50µL of Std.2 (2.5mmol/L) | 50 | 1.25 |
Std.4 | 50µL of Std.3 (1.25mmol/L) | 50 | 0.625 |
Std.5 | 50µL of Std.4 (0.625mmol/L) | 50 | 0.313 |
Std.6 | 50µL of Std.5 (0.313mmol/L) | 50 | 0.156 |
Std.7 | 50µL of Std.6 (0.156mmol/L) | 50 | 0.078 |
Std.8 | 0 | 100 | 0 |
注意：每次实验都需要新配制标准品。
样本制备
取血后3小时内分离血清，让样品在室温下凝结30 min，然后1,000 g离心15 min，取上层血清立即测定或分装-80℃保存，避免反复冻融。将血清样品与提取液按照 1:1 的比例充分混匀，25℃静置 15 min，2,000 g离心15 min，取上清置于冰上待测。
注意：推荐使用新鲜血清样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到500nm，可见分光光度计去离子水调零；恒温箱预热到37℃。
2. 样本测定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：
标准（μL） | 测定（μL） | |
不同浓度标准品 | 20 | 0 |
样本 | 0 | 20 |
工作液 | 200 | 200 |
3. 混匀，37℃静置 30min，测定 500nm 处吸光值A。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
所有孔吸光值 A减去零浓度（Std.8）的吸光值得ΔA。
以标准液浓度为y轴，ΔA标准为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测定带入方程得到y值（mmol/L）。
2. 高密度脂蛋白（HDL-C）含量计算
HDL-C含量（mmol/L）= 2×y
其中，2：样本制备过程中的稀释倍数=(1+1)/1=2
结果展示
典型标准曲线-数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线
