产品简介
游离胆固醇（FC）是构成细胞膜的主要成分，也是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料。组织游离胆固醇（FC）浓度可作为脂代谢的指标。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本如动物组织、细胞（细菌）、血清（浆）中游离胆固醇（FC）的含量。胆固醇氧化酶催化游离胆固醇（FC）生成△4-胆甾烯酮和H2O2，过氧化物酶催化H2O2、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，在500nm有吸收峰，其颜色深浅与FC含量成正比。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | ||
48T | 96T | |||
试剂一 | 7.5mL | 15mL | 4℃避光保存 | |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃避光保存 | |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃保存 | |
标准品 | 0.25mL | 0.5mL | 4℃避光保存 | |
标准品稀释液 | 5mL | 10mL | 4℃保存 | |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测500nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
异丙醇、去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
标准品稀释液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前96T加入5mL 试剂三，48T加入2.5mL 试剂三充分混匀待用。用不完的试剂可4℃保存一周或分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
标准品：含5mmol/L 胆固醇标准品；4℃避光保存。
工作液的配制：每孔配制200µL工作液：吸取50µL溶解后的试剂二，150µL试剂一。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。
标准曲线设置：按下表所示，用标准品稀释液将5mmol/L 胆固醇标准品稀释为5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0 mmol/L 的标准溶液。
标准品体积 | 标准品稀释液体积（µL） | 标准品浓度（mmol/L） | |
Std.1 | 100µL 5mmol/L | 0 | 5 |
Std.2 | 50µL of Std.1 (5mmol/L) | 50 | 2.5 |
Std.3 | 50µL of Std.2 (2.5mmol/L) | 50 | 1.25 |
Std.4 | 50µL of Std.3 (1.25mmol/L) | 50 | 0.625 |
Std.5 | 50µL of Std.4 (0.625mmol/L) | 50 | 0.313 |
Std.6 | 50µL of Std.5 (0.313mmol/L) | 50 | 0.156 |
Std.7 | 50µL of Std.6 (0.156mmol/L) | 50 | 0.078 |
Std.8 | 0 | 100 | 0 |
注意：每次实验都需要新配制标准品。
样本制备
动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL异丙醇，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 异丙醇，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到500nm，可见分光光度计去离子水调零；恒温箱预热到37℃。工作液在37℃中预热30min以上。
2.样本游离胆固醇（FC）含量测定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：
标准（μL） | 测定（μL） | |
不同浓度标准品 | 20 | 0 |
样本 | 0 | 20 |
工作液 | 200 | 200 |
2. 混匀，37℃静置 30min，测定 500nm 处吸光值 A。标准孔记为A标，测定孔记为A测。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果A测大于2.0，样本可用异丙醇进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
所有孔吸光值 A减去零浓度（Std.8）的吸光值得ΔA。
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入方程得到y值（mmol/L即μmol/mL）。
2. 样本游离胆固醇（FC）含量计算
（1）按样本质量计算
FC含量（μmol/g 质量）=y×V样÷(W×V样÷V样总) ×n=y÷W×n
（2）按细菌或细胞数量计算
FC含量(μmol/104 cells)==y×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n=0.002×y×n
（3）按液体体积计算
FC含量（μmol/mL）=y×V样÷V样×n=y×n
V样：加入样本体积，0.02mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；n：样本稀释倍数； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞数量，500万。
结果展示
典型标准曲线-数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线
