产品简介
游离脂肪酸 (FFA )，也称为非酯化脂肪酸，既是脂肪水解的产物，又是脂肪合成的底物,在与白蛋白结合的血浆中循环。血清中FFA的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关，FFA的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而上升。本试剂盒可检测生物体内游离脂肪酸含量，其原理是FFA与铜离子结合形成脂肪酸铜盐，并溶于氯仿；利用铜试剂法测定铜离子含量，即可推算出游离脂肪酸含量。可以检测血清（浆）、动植物组织、细胞、细菌等样本。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 5.375mL | 10.75mL | 4℃避光保存 |
试剂二 | 15mL | 30mL | 4℃避光保存 |
标准品（16.41mg 棕榈酸） | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测550nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、制冰机、低温离心机
玻璃瓶（用于配制提取液）
匀浆器（如果是组织样本）
正庚烷、无水甲醇、氯仿（三氯甲烷）
试剂准备
提取液（自备）：取一个玻璃瓶，按照氯仿：正庚烷：无水甲醇=30:30:1.2 的比例配制，盖紧后混匀，4℃避光保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
标准品：临用前配制，加1mL提取液，充分溶解得到64mM 标准品，未用完的已溶解的标准品可装于玻璃瓶中盖紧密封，4℃避光保存。
标准曲线设置：把64mM标准品按下表所示，用提取液进行下一步稀释。
标准品体积（µL） | 提取液体积（µL） | 标准品浓度（mM） | |
Std.1 | 20µL of 64mM | 620 | 2 |
Std.2 | 100µL of Std.1 (2mM) | 100 | 1 |
Std.3 | 100µL of Std.2 (1mM) | 100 | 0.5 |
Std.4 | 100µL of Std.3 (0.5mM) | 100 | 0.25 |
Std.5 | 100µL of Std.4 (0.25mM) | 100 | 0.125 |
Std.6 | 100µL of Std.5 (0.125mM) | 100 | 0.0625 |
Std.7 | 100µL of Std.6 (0.0625mM) | 100 | 0.0313 |
注意：每次实验，请使用新稀释的标准品。
样本制备
动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000rpm，4℃离心10min，取清液，置冰上待测。
植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液捣碎，冰浴超声波破碎5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000rpm，4℃离心 10min，取清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000rpm，4℃离心10min，取清液，置冰上待测。
血清（浆）：取0.1mL液体样本，加入1mL提取液混匀，8,000rpm，4℃离心10min，取清液，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到550nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） | |
提取液 | 240 | 200 | 200 |
不同浓度标准品 | 0 | 40 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 40 |
混匀后盖紧瓶盖，置于涡旋混合器上中速涡旋30s | |||
试剂一 | 80 | 80 | 80 |
混匀后盖紧瓶盖，置于涡旋混合器上中速涡旋30s，室温（25℃）放置20min；8,000rpm，室温（25℃）离心5 min，取清液50uL到新的EP管中（注意不要吸到蓝绿色悬浊部分） | |||
清液 | 50 | 50 | 50 |
试剂二 | 200 | 200 | 200 |
3. 室温（25℃）放置5min。每管取出200μL加入96孔板或微量玻璃比色皿中，于550nm测定吸光值，计算ΔA测=A测定-A空白、ΔA标=A标准-A空白（空白管只需做1 管）。显色后务必在30min内测完。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验，如果A测定大于酶标仪检测范围，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴， ΔA标为x轴绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入标准曲线公式计算出y（mM即μmol/mL）。
2. 样本FFA含量计算
（1）按样本质量计算
FFA含量（μmol/g 质量）=y×V提取÷W×n=y÷W×n
（2）按细菌或细胞数量计算
FFA含量(μmol/104 cells)=y÷(细胞数量÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n
（3）按液体体积计算
FFA含量（μmol/mL）=y×V提取÷V液×n=10×y×n
V提取：加入提取液体积，1mL；V液：液体样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；n：样本进一步稀释的稀释倍数；500：细菌或细胞总数，500万个。
