产品简介
FAS是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。本试剂盒可检测生物体内FAS活性，其原理是：FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm光吸收下降速率，计算FAS活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | -20℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃保存 |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃保存 |
试剂四 | 1 | 1 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；用前一天取出置于4℃充分解冻后混匀，平衡到室温；-20℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前96T加入1.64mL 试剂一，48T加入0.82mL 试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：临用前96T加入0.44mL 试剂一，48T加入0.22mL 试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：临用前96T加入0.84mL 试剂一，48T加入0.42mL 试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
工作液的配制：每孔配制180µL工作液：吸取16µL溶解后的试剂二，4µL溶解后的试剂三，8µL溶解后的试剂四和152µL 试剂一。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。
样本制备
动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心40min，取上清液，置冰上待测。
植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液捣碎，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后12,000g，4℃离心40min，取上清液，置冰上待测。
细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后12,000g，4℃离心40min，取上清液，置冰上待测。
1. 血清（浆）等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。
2. 恒温箱预热到37℃，工作液置于恒温箱中预热 15min以上。
3. 在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中依次加入20μL样本和180μL工作液，迅速混匀，测定340nm处吸光值。记录第1min和6min时吸光值，分别记录为A1和A2。△A=A1-A2。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA大于0.4，样本可用提取液进一步稀释（计算结果乘以稀释倍数），或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH为1个酶活单位。
FAS 酶活(U/mg prot)= [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T×n=643×△A÷Cpr×n
2. 按照样本质量计算
活性单位定义：每g组织在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH为1个酶活单位。
FAS 酶活(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T×n=643×△A÷W×n
3. 按细胞数量计算
活性单位定义：每104个细胞在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH为1个酶活单位。
FAS酶活(U/104 cells)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T×n=1.286×ΔA×n
4. 按液体体积计算
活性单位定义：每mL样本在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH为1个酶活单位。
FAS 酶活(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T×n =643×△A×n
ε：试剂二摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，L，200 μL=2×10-4L；109：1 mol=1×109 nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V样：加入上清液体积，0.02 mL；T：反应时间，5min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；V样总：提取液体积，1 mL；500：细胞总数，500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5 cm调整为d:1 cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
