产品简介
FAS是脂肪酸合成关键酶,催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中,在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。本试剂盒可检测生物体内FAS活性,其原理是:FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+;NADPH在340nm有吸收峰,而NADP+没有;通过测定340nm光吸收下降速率,计算FAS活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | -20℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃保存 |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃保存 |
试剂四 | 1 | 1 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;用前一天取出置于4℃充分解冻后混匀,平衡到室温;-20℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:临用前96T加入1.64mL 试剂一,48T加入0.82mL 试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:临用前96T加入0.44mL 试剂一,48T加入0.22mL 试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:临用前96T加入0.84mL 试剂一,48T加入0.42mL 试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
工作液的配制:每孔配制180µL工作液:吸取16µL溶解后的试剂二,4µL溶解后的试剂三,8µL溶解后的试剂四和152µL 试剂一。工作液需现配现用,根据需要测定的样本数按比例配制。
样本制备
动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,12,000g,4℃离心40min,取上清液,置冰上待测。
植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液捣碎,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后12,000g,4℃离心40min,取上清液,置冰上待测。
细胞:收集500万细胞到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后12,000g,4℃离心40min,取上清液,置冰上待测。
1. 血清(浆)等液体样本:直接测定。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。
2. 恒温箱预热到37℃,工作液置于恒温箱中预热 15min以上。
3. 在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中依次加入20μL样本和180μL工作液,迅速混匀,测定340nm处吸光值。记录第1min和6min时吸光值,分别记录为A1和A2。△A=A1-A2。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA大于0.4,样本可用提取液进一步稀释(计算结果乘以稀释倍数),或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按照蛋白浓度计算
活性单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH为1个酶活单位。
FAS 酶活(U/mg prot)= [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T×n=643×△A÷Cpr×n
2. 按照样本质量计算
活性单位定义:每g组织在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH为1个酶活单位。
FAS 酶活(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T×n=643×△A÷W×n
3. 按细胞数量计算
活性单位定义:每104个细胞在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH为1个酶活单位。
FAS酶活(U/104 cells)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T×n=1.286×ΔA×n
4. 按液体体积计算
活性单位定义:每mL样本在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH为1个酶活单位。
FAS 酶活(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T×n =643×△A×n
ε:试剂二摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5 cm;V反总:反应体系总体积,L,200 μL=2×10-4L;109:1 mol=1×109 nmol;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;V样:加入上清液体积,0.02 mL;T:反应时间,5min;n:样本稀释倍数;W:样品质量,g;V样总:提取液体积,1 mL;500:细胞总数,500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5 cm调整为d:1 cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。