脂肪酸系列

脂肪酸合成酶(FAS)检测试剂盒(微量法)

货号:PMK1019
规格:48T/96T
价格:3660元/6100元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

FAS是脂肪酸合成关键酶,催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中,在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。试剂盒可检测生物体内FAS活性,其原理是:FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+NADPH340nm有吸收峰,而NADP+没有;通过测定340nm光吸收下降速率,计算FAS活性。

 

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48 T

96 T

提取液

50mL

100mL

-20保存

试剂一

10mL

20mL

4保存

试剂二

1

1

-20保存

试剂三

1

1

-20保存

试剂四

1

1

-20保存

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)

恒温箱、制冰机、低温离心机

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

提取液:即用型;用前一天取出置于4℃充分解冻后混匀,平衡到室温;-20℃保存。

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂二:临用前96T加入1.64mL 试剂一48T加入0.82mL 试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:临用前96T加入0.44mL 试剂一48T加入0.22mL 试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四临用前96T加入0.84mL 试剂一48T加入0.42mL 试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

工作液的配制:每孔配制180µL工作液:吸取16µL溶解后的试剂二4µL溶解后的试剂三8µL溶解后的试剂四152µL 试剂一。工作液需现配现用,根据需要测定的样本数按比例配制。

样本制备

动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,12,000g,4℃离心40min,取上清液,置冰上待测。

植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液捣碎,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后12,000g,4℃离心40min,取上清液,置冰上待测。

细胞:收集500万细胞到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后12,000g,4℃离心40min,取上清液,置冰上待测。

1. 血清(浆)等液体样本:直接测定。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

 

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。

2. 恒温箱预热到37℃,工作液置于恒温箱中预热 15min以上。

3. 96孔UV微孔板或微量石英比色皿中依次加入20μL样本和180μL工作液,迅速混匀,测定340nm处吸光值。记录第1min6min时吸光值,分别记录为A1A2△A=A1-A2

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA大于0.4,样本可用提取液进一步稀释(计算结果乘以稀释倍数),或减少提取用样本量。

 

结果计算

A. 使用96孔板测定的计算公式

1. 按照蛋白浓度计算

活性单位定义:mg组织蛋白在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH1个酶活单位。

FAS 酶活(U/mg prot)= [ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V)÷T×n=643×△A÷Cpr×n  

2. 按照样本质量计算

活性单位定义:每g组织在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH1个酶活单位。

FAS 酶活(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V÷V样总)÷T×n=643×△A÷W×n

3. 按细胞数量计算

活性单位定义:每104个细胞在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH1个酶活单位。

FAS酶活(U/104 cells)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V÷V样总)÷T×n=1.286×ΔA×n

4. 按液体体积计算

活性单位定义:每mL样本在反应体系中每分钟氧化1nmol NADPH1个酶活单位。

FAS 酶活(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V÷T×n =643×△A×n

ε:试剂二摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5 cm;V反总:反应体系总体积,L,200 μL=2×10-4L;1091 mol=1×109 nmol;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;V:加入上清液体积,0.02 mL;T:反应时间,5min;n:样本稀释倍数;W:样品质量,g;V样总:提取液体积,1 mL;500:细胞总数,500万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径d:0.5 cm调整为d:1 cm进行计算即可。

注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。


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