糖酵解系列

丙酮酸(PA)检测试剂盒(微量法)

货号:PMK1116
规格:48T/96T
价格:410元/680元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

丙酮酸(PA)通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢,起着重要的枢纽作用。试剂提供了一种简单易用的比色法,用于分析各种生物样本中的丙酮酸含量,其原理是样品中丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在碱性溶液中呈红色,该红色化合物在520nm处有最大吸收峰。在一定的浓度范围内,丙酮酸含量与520nm吸光度成线性关系,根据标准曲线,即可计算出样品中丙酮酸含量。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

提取液

60mL

120mL

4℃保存

试剂一

1.5mL

3mL

4℃避光保存

试剂二

7.5mL

15mL

4℃保存

标准品1mg/mL)

1mL

1mL

4℃保存

自备耗材

酶标仪可见分光光度计(能检测520nm)

96孔板或微量玻璃比色皿可调节式移液枪及枪头

离心机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。

试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

标准品制备:

标准曲线设置:按下表所示用提取液1mg/mL标准溶液稀释至70、35、17.5、8.75、4.375、2.188、1.094 µg/mL的标准液。


标准品体积

提取液µL)

标准品浓度(µg/mL)

Std.1

35µL 1mg/mL

465

70

Std.2

200µL of Std.1 (70µg/ml)

200

35

Std.3

200µL of Std.2 (35µg/ml)

200

17.5 

Std.4

200µL of Std.3 (17.5µg/ml)

200

8.75

Std.5

200µL of Std.4 (8.75µg/ml)

200

4.375

Std.6

200µL of Std.5 (4.375µg/ml)

200

2.188

Std.7

200µL of Std.6 (2.188µg/ml)

200

1.094

注意:每次实验,请使用新配制的标准品

样本制备

动物组织:称取约0.1g组织,加入1mL 提取液匀浆,静置30min,4,000g,常温离心10min,取上清液待测。

植物组织:称取约0.1g组织,加入1mL 提取液匀浆,然后超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),静置30min,4,000g,常温离心10min,取上清液待测。

细胞/细菌:收集 500万细胞或细菌到离心管内,弃上清,加1mL 提取液,超声波破碎5min功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),静置30min,4,000g,常温离心10min,取上清液待测。

血清(浆)样品:取100μL血清(浆)加入1mL 提取液,充分混匀,静置30min,4,000g,常温离心10min,取上清液待测。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长至520nm,去离子水调零;

2. 样本测定(在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂):

试剂名称

空白孔(μL)

标准孔(μL)

测定孔(μL)

待测样本

0

0

75

不同浓度的标准品

0

75

0

提取液

75

0

0

试剂一

25

25

25

混匀后,室温静置2min

试剂二

125

125

125

3. 混匀,在520nm波长处测定各孔的吸光值A。计算相对吸光值ΔA=A测定-A空白ΔA=A标准-A空白。(空白孔只需做一管)

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于2.0,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准液浓度为 y 轴,ΔAx轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将ΔA带入方程计算出y(µg/mL)。

2. 样本丙酮酸含量计算

(1)按样本质量计算:

丙酮酸含量(µg/g 质量)=(y×V)÷(W×V÷V提取)×n=y÷W×n

(2)按血清(浆)等液体积计算:

丙酮酸含量(µg/mL)=(y×V)÷(V×V÷V提取)×n=10×y×n

(3)按照细菌或细胞数量计算:

丙酮酸含量(µg/104 Cells)=(y×V)÷(500×V÷V提取)×n= y÷500×n

V:加入的样本体积,0.075 mL;V提取:加入提取液体积,1 mL;W:样本质量,g;n:稀释倍数;V:液体样本体积,0.1mL;500:细菌或细胞数量,500万。

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

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