产品简介
丙酮酸(PA)通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢,起着重要的枢纽作用。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法,用于分析各种生物样本中的丙酮酸含量,其原理是样品中丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在碱性溶液中呈红色,该红色化合物在520nm处有最大吸收峰。在一定的浓度范围内,丙酮酸含量与520nm吸光度成线性关系,根据标准曲线,即可计算出样品中丙酮酸含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 60mL | 120mL | 4℃保存 |
试剂一 | 1.5mL | 3mL | 4℃避光保存 |
试剂二 | 7.5mL | 15mL | 4℃保存 |
标准品(1mg/mL) | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计(能检测520nm)
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
标准品制备:
标准曲线设置:按下表所示用提取液将1mg/mL标准溶液稀释至70、35、17.5、8.75、4.375、2.188、1.094 µg/mL的标准液。
标准品体积 | 提取液(µL) | 标准品浓度(µg/mL) | |
Std.1 | 35µL 1mg/mL | 465 | 70 |
Std.2 | 200µL of Std.1 (70µg/ml) | 200 | 35 |
Std.3 | 200µL of Std.2 (35µg/ml) | 200 | 17.5 |
Std.4 | 200µL of Std.3 (17.5µg/ml) | 200 | 8.75 |
Std.5 | 200µL of Std.4 (8.75µg/ml) | 200 | 4.375 |
Std.6 | 200µL of Std.5 (4.375µg/ml) | 200 | 2.188 |
Std.7 | 200µL of Std.6 (2.188µg/ml) | 200 | 1.094 |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品。
样本制备
动物组织:称取约0.1g组织,加入1mL 提取液匀浆,静置30min,4,000g,常温离心10min,取上清液待测。
植物组织:称取约0.1g组织,加入1mL 提取液匀浆,然后超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),静置30min,4,000g,常温离心10min,取上清液待测。
细胞/细菌:收集 500万细胞或细菌到离心管内,弃上清,加1mL 提取液,超声波破碎5min功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),静置30min,4,000g,常温离心10min,取上清液待测。
血清(浆)样品:取100μL血清(浆)加入1mL 提取液,充分混匀,静置30min,4,000g,常温离心10min,取上清液待测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长至520nm,去离子水调零;
2. 样本测定(在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂):
试剂名称 | 空白孔(μL) | 标准孔(μL) | 测定孔(μL) |
待测样本 | 0 | 0 | 75 |
不同浓度的标准品 | 0 | 75 | 0 |
提取液 | 75 | 0 | 0 |
试剂一 | 25 | 25 | 25 |
混匀后,室温静置2min | |||
试剂二 | 125 | 125 | 125 |
3. 混匀,在520nm波长处测定各孔的吸光值A。计算相对吸光值ΔA测=A测定-A空白、ΔA标=A标准-A空白。(空白孔只需做一管)
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测大于2.0,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为 y 轴,ΔA标为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将ΔA测带入方程计算出y(µg/mL)。
2. 样本丙酮酸含量计算
(1)按样本质量计算:
丙酮酸含量(µg/g 质量)=(y×V样)÷(W×V样÷V提取)×n=y÷W×n
(2)按血清(浆)等液体积计算:
丙酮酸含量(µg/mL)=(y×V样)÷(V液×V样÷V提取)×n=10×y×n
(3)按照细菌或细胞数量计算:
丙酮酸含量(µg/104 Cells)=(y×V样)÷(500×V样÷V提取)×n= y÷500×n
V样:加入的样本体积,0.075 mL;V提取:加入提取液体积,1 mL;W:样本质量,g;n:稀释倍数;V液:液体样本体积,0.1mL;500:细菌或细胞数量,500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。