产品简介
丙酮酸（PA）通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于分析各种生物样本中的丙酮酸含量，其原理是样品中丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈红色，该红色化合物在520nm处有最大吸收峰。在一定的浓度范围内，丙酮酸含量与520nm吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可计算出样品中丙酮酸含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 60mL | 120mL | 4℃保存 |
试剂一 | 1.5mL | 3mL | 4℃避光保存 |
试剂二 | 7.5mL | 15mL | 4℃保存 |
标准品（1mg/mL） | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能检测520nm）
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
标准品制备：
标准曲线设置：按下表所示用提取液将1mg/mL标准溶液稀释至70、35、17.5、8.75、4.375、2.188、1.094 µg/mL的标准液。
标准品体积 | 提取液（µL） | 标准品浓度（µg/mL） | |
Std.1 | 35µL 1mg/mL | 465 | 70 |
Std.2 | 200µL of Std.1 (70µg/ml) | 200 | 35 |
Std.3 | 200µL of Std.2 (35µg/ml) | 200 | 17.5 |
Std.4 | 200µL of Std.3 (17.5µg/ml) | 200 | 8.75 |
Std.5 | 200µL of Std.4 (8.75µg/ml) | 200 | 4.375 |
Std.6 | 200µL of Std.5 (4.375µg/ml) | 200 | 2.188 |
Std.7 | 200µL of Std.6 (2.188µg/ml) | 200 | 1.094 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
动物组织：称取约0.1g组织，加入1mL 提取液匀浆，静置30min，4,000g，常温离心10min，取上清液待测。
植物组织：称取约0.1g组织，加入1mL 提取液匀浆，然后超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），静置30min，4,000g，常温离心10min，取上清液待测。
细胞/细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加1mL 提取液，超声波破碎5min功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），静置30min，4,000g，常温离心10min，取上清液待测。
血清（浆）样品：取100μL血清（浆）加入1mL 提取液，充分混匀，静置30min，4,000g，常温离心10min，取上清液待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，去离子水调零；
2. 样本测定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：
试剂名称 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） |
待测样本 | 0 | 0 | 75 |
不同浓度的标准品 | 0 | 75 | 0 |
提取液 | 75 | 0 | 0 |
试剂一 | 25 | 25 | 25 |
混匀后，室温静置2min | |||
试剂二 | 125 | 125 | 125 |
3. 混匀，在520nm波长处测定各孔的吸光值A。计算相对吸光值ΔA测=A测定-A空白、ΔA标=A标准-A空白。（空白孔只需做一管）
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测大于2.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为 y 轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入方程计算出y（µg/mL）。
2. 样本丙酮酸含量计算
（1）按样本质量计算：
丙酮酸含量（µg/g 质量）=(y×V样)÷(W×V样÷V提取)×n=y÷W×n
（2）按血清（浆）等液体积计算：
丙酮酸含量（µg/mL）=(y×V样)÷(V液×V样÷V提取)×n=10×y×n
（3）按照细菌或细胞数量计算：
丙酮酸含量（µg/104 Cells）=(y×V样)÷(500×V样÷V提取)×n= y÷500×n
V样：加入的样本体积，0.075 mL；V提取：加入提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；n：稀释倍数；V液：液体样本体积，0.1mL；500：细菌或细胞数量，500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
