产品简介
丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK, EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本中PK的活性。其原理是PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，NADH在340nm有特征吸收峰，而NAD+没有，通过测定340nm光吸收下降速率，即可反映PK活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1 | 1 | -20℃保存 |
试剂三 | 1 | 1 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及水浴锅
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前配制，48T的试剂二瓶中加入8.5mL试剂一和0.5mL去离子水充分溶解，在96T的试剂二瓶中加入17mL试剂一和1mL去离子水充分溶解；溶解以后分装-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：临用前配制，在48T的试剂三中加入0.5mL去离子水充分混匀，在96T的试剂三中加入1mL去离子水充分混匀，冰上放置备用；溶解以后的试剂分装-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
动植物组织样本：称取约0.1g样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞、细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清等液体样本：直接测定，根据预实验结果确定稀释倍数。
注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
2. 对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。
实验步骤
1．酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2．试剂二 置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育5min。
3．样本测定：在96 孔UV微孔板或微量石英比色皿中加入10μL样本，10μL试剂三和180μL试剂二，迅速混匀。用酶标仪在340nm下测定20s时的吸光值A1和2min 20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于1.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用 96孔UV板测定的计算公式如下
1．血清（浆）等液体样本中PK活力的计算:
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=3215×ΔA
2．组织、细菌或细胞中PK活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK(U/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=3215×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK(U/g 鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=3215×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 104个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK(U/104 Cells)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=3215×ΔA÷500=6.431×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm； 109：1 mol=1×109 nmol； V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g； 500：细菌或细胞总数，5×106。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
