产品简介
己糖激酶（HK，EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。本试剂盒可检测各种生物样本中己糖激酶（HK）活性，其原理是HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，生成的NADPH将WST-8还原生成橙黄色的formazan（甲臜），在450nm左右检测有最大吸收峰。通过检测450nm处光吸收增加速率来计算该酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 12mL | 24mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
试剂三 | 60µL | 120µL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 300µL | 600µL | 4℃避光保存 |
试剂五 | 60µL | 120µL | 4℃避光保存 |
NADPH标准品 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测450nm处的吸光度）及恒温培养箱
96孔板或微量玻璃比色皿、移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前配制，48T加入11mL试剂一；96T加入22mL试剂一，充分溶解。未用完的已溶解的试剂二可4℃保存一周。若需长期保存，请分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
试剂四：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂五：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
工作液的配制：每孔配制190µL工作液：吸取183µL试剂二，1µL试剂三，5µL试剂四, 1µL试剂五。工作液需现配现用。
NADPH标准品：临用前配制，加1mL去离子水，充分溶解得到2,000µM标准品，未用完的已溶解的NADPH标准品可4℃保存一周。若需长期保存，请分装后-20℃保存，避免反复冻融。
标准曲线设置：按下表所示，用去离子水将2,000 µM标准品稀释为2,000、1,000、500、250、125、62.5、31.25 µM 的标准溶液。
标准品体积 | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（µM） | |
Std.1 | 200µL 2,000µM | 0 | 2,000 |
Std.2 | 100µL of Std.1 (2,000µM) | 100 | 1,000 |
Std.3 | 100µL of Std.2 (1,000µM) | 100 | 500 |
Std.4 | 100µL of Std.3 (500µM) | 100 | 250 |
Std.5 | 100µL of Std.4 (250µM) | 100 | 125 |
Std.6 | 100µL of Std.5 (125µM) | 100 | 62.5 |
Std.7 | 100µL of Std.5 (62.5µM) | 100 | 31.25 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
1. 动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
2. 植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL 提取液捣碎，冰浴超声波破碎 5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）：直接测定。
注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
2. 对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 测定孔在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10µL样本和190μL工作液；充分混匀后，立即记录 450nm 处 20s时的吸光值 A1和5min20s后的吸光值 A2，计算 ΔA测=A2-A1。
3. 标准孔在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10µL不同浓度标准品和190μL工作液；空白孔在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10µL去离子水和190μL工作液充分混匀后，室温孵育5min，测定450nm处的吸光值，计算ΔA标=A标准-A空白。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本ΔA>1.5，则说明样本酶活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度。（计算公式中乘以相应稀释倍数）
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入方程得到y值（1µM=1 nmol/mL）即NADPH含量。
2. HK活性计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
HK（U/mg prot）＝y×V反总÷(V样×Cpr)÷T×n =4y÷Cpr×n
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
HK（U/g鲜重）＝y×V反总÷（V样÷V样总×W）T×n =4y÷W×n
（3）按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
HK（U/104 cell）=y×V反总÷（V样÷V样总×500）÷T×n=0.008y×n
（4）按液体样本体积计算
单位的定义：每毫升液体样本在在反应体系中每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
HK（U/mL）=y×V反总÷V样÷T×n=4y×n
V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，5min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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