产品简介
磷酸果糖激酶(PFK,EC 2.7.1.11),又称为6-磷酸果糖激酶或果糖-6-磷酸激酶,存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。本试剂盒提供了一种简单的检测方法,用于检测生物样本中磷酸果糖激酶(PFK)活性。其原理是PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,NADH在340nm有特征吸收峰,而NAD+没有,通过测定340nm光吸收下降速率,即可反映PFK活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃,保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃,保存 |
试剂二 | 1 | 1 | 4℃,避光保存 |
试剂三 | 500μL | 1mL | -20℃,避光保存 |
试剂四 | 500μL | 1mL | -20℃,避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)及恒温培养箱
96孔UV板或微量石英比色皿、移液枪及枪头
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:临用前配制,加入试剂一和去离子水充分溶解。48T的试剂盒需要8.5mL 试剂一和0.565mL去离子水;96T试剂盒需要17mL 试剂一和1.13mL去离子水),未用完的已溶解的试剂二可4℃保存一周。若需长期保存,请分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;-20℃避光保存。
试剂四:即用型;使用前,平衡到室温;-20℃避光保存。
样本制备
1. 动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液置冰上待测。
2. 植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液捣碎,冰浴超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
3. 细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
4. 血清(浆):直接测定。
注意:1. 推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
2.对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm,紫外分光光度计去离子水调零。
2. 测定孔在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10µL样本、10µL试剂三、10µL试剂四和170µL已溶解的试剂二,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和10min 20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于0.5,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用96孔UV板测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=643×ΔA÷W×n
2. 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=643×ΔA÷Cpr×n
3. 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=1.286×ΔA×n
4. 按血清(浆)等液体体积计算
单位的定义:每毫升液体样本在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=643×ΔA×n
V反总:反应体系总体积,2.0×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 mol/L/cm;d:96孔板光径,0.5cm;109:1mol=1×109 nmol;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g;T:反应时间,10min;n:样本稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细菌或细胞总数,500万。
B.使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。