产品简介

磷酸果糖激酶（PFK，EC 2.7.1.11），又称为6-磷酸果糖激酶或果糖-6-磷酸激酶，存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本中磷酸果糖激酶（PFK）活性。其原理是PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，NADH在340nm有特征吸收峰，而NAD⁺没有，通过测定340nm光吸收下降速率，即可反映PFK活性。

产品内容

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及恒温培养箱

96孔UV板或微量石英比色皿、移液枪及枪头

去离子水 

匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂二：临用前配制，加入试剂一和去离子水充分溶解。48T的试剂盒需要8.5mL 试剂一和0.565mL去离子水；96T试剂盒需要17mL 试剂一和1.13mL去离子水），未用完的已溶解的试剂二可4℃保存一周。若需长期保存，请分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。

试剂四：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。

样本制备

1. 动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。

2. 植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液捣碎，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

3. 细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

4. 血清（浆）：直接测定。

注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

2.对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计去离子水调零。

2. 测定孔在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10µL样本、10µL试剂三、10µL试剂四和170µL已溶解的试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A₁和10min 20s后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于0.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

A. 使用96孔UV板测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/g 鲜重)＝[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_样总×W)÷T=643×ΔA÷W×n

2. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/mg prot)＝[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V_样)÷T=643×ΔA÷Cpr×n

3. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/10⁴ cell)＝[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_样总×500)÷T=1.286×ΔA×n

4. 按血清（浆）等液体体积计算

单位的定义：每毫升液体样本在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmol ATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/mL)＝[ΔA×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷V_样÷T=643×ΔA×n

V_反总：反应体系总体积，2.0×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5cm；10⁹：1mol=1×10⁹ nmol；V_样：加入样本体积，0.01mL；V_样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；T：反应时间，10min；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万。

B.使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。